曹艷林,龔永祿,何 青,吳建華,陳麗華

(1.常德市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南 常德 415000;2.常德市第一人民醫(yī)院兒科,湖南 常德 415000;3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南 長(zhǎng)沙 410013)

新生兒敗血癥是指病原體侵入新生兒血液循環(huán)并生長(zhǎng)繁殖而引起的全身炎性反應(yīng)綜合征,從患兒血液、腦脊液等無(wú)菌腔隙體液能培養(yǎng)出致病菌[1]。患兒病情大多比較嚴(yán)重,病死率也較高[2]。該病治療費(fèi)用相對(duì)較高,對(duì)家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)[3]。范含笑等[4]研究報(bào)道,目前我國(guó)新生兒敗血癥發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒中占0.1%～1.0%,住院新生兒病死率高達(dá)10.3%,且發(fā)生機(jī)制尚不清楚,敗血癥的早期診斷對(duì)提高患兒的預(yù)后有重要的臨床意義。目前,對(duì)于新生兒敗血癥的實(shí)驗(yàn)室診斷、免疫學(xué)研究及相關(guān)治療的問(wèn)題亟待解決。

輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17,Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T,Treg)是當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[5]。周洋等[6]和Punt等[7]研究發(fā)現(xiàn),Th17/Treg細(xì)胞平衡機(jī)制及其相關(guān)因子的變化,對(duì)促進(jìn)機(jī)體清除病原體的入侵和抵制炎癥反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。而白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)作為免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子,不僅參與炎癥反應(yīng),也介導(dǎo)了Th17與Treg細(xì)胞的增殖和分化。Ye等[8]研究發(fā)現(xiàn),IL-6是早期診斷新生兒敗血癥最具敏感性的炎癥指標(biāo)。我們的前期研究證實(shí):新生兒敗血癥患兒外周血中IL-6水平出現(xiàn)了明顯變化[9]。因此,我們推測(cè)敗血癥患兒體內(nèi)IL-6水平的變化可能打破了患兒的免疫平衡,進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。為了證實(shí)該問(wèn)題,本研究探討了外周血中IL-6、IL-17、Th17與Treg細(xì)胞在新生兒敗血癥治療前后表達(dá)水平的變化及臨床價(jià)值,旨為新生兒敗血癥的臨床診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

收集常德市第一人民醫(yī)院2020年8月至2022年1月期間確診為新生兒敗血癥患者86例作為觀察組(其中早產(chǎn)兒47例,足月兒39例),入選標(biāo)準(zhǔn)按照2019年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組制訂的專(zhuān)家共識(shí)[1]:①疑似診斷,即出生3日齡內(nèi)的新生兒有下列任何一項(xiàng)者:異常臨床表現(xiàn)、母親有絨毛膜羊膜炎、早產(chǎn)胎膜早破大于18h。如無(wú)異常臨床表現(xiàn),血培養(yǎng)陰性,間隔24h的連續(xù)2次血非特異性檢查2項(xiàng)以下陽(yáng)性,則可排除敗血癥。②有異常臨床表現(xiàn),同時(shí)滿(mǎn)足下列條件中任何一項(xiàng):有2項(xiàng)以上的血液非特異性檢查陽(yáng)性;腦脊液檢查為化膿性腦膜炎改變;血中檢出致病菌DNA。③確定診斷為有臨床表現(xiàn),血培養(yǎng)或腦脊液(或其他無(wú)菌腔液)培養(yǎng)陽(yáng)性。新生兒晚發(fā)型敗血癥臨床診斷和確定診斷發(fā)生在3日齡以上的新生兒,其余條件同新生兒早發(fā)型敗血癥。排除標(biāo)準(zhǔn):①近7d內(nèi)使用影響造血功能及免疫功能的藥物;②確診為白血病等血液系統(tǒng)疾病者;③產(chǎn)婦患有其他基礎(chǔ)疾病者;④產(chǎn)婦為少數(shù)民族者;⑤產(chǎn)婦有吸煙嗜酒史者。選取同期收治的129例新生兒科非敗血癥患者作為對(duì)照組。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(編號(hào):2020-089-01)。所有患兒家長(zhǎng)都知情并自愿簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2細(xì)胞因子的檢測(cè)方法

1.2.1儀器與試劑

人淋巴細(xì)胞分離液(批號(hào):KLSH2001,規(guī)格:100mL),佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)+Ionomycin(離子霉素)淋巴細(xì)胞刺激物[批號(hào):PI-2014,規(guī)格:50(test,T)]和RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào):RPMI12003,規(guī)格:500mL)購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物工程有限公司。PE anti-human FOXP3(批號(hào):B279946,規(guī)格:100T),FOXP3 Fix/Perm Buffer Set(批號(hào):B335925,規(guī)格:100T),PerCP/Cyanine5.5 anti-human IL-17A(批號(hào):B327457,規(guī)格:100T),PE Mouse IgG1,κ Isotype Ctrl(ICFC)(批號(hào):B338362,規(guī)格:25T),PerCP/Cyanine5.5 Mouse IgG1,κ Isotype Ctrl(批號(hào):B286218,規(guī)格:25T),Monensin Solution (1 000×,批號(hào):B323668,規(guī)格:1mL)和BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司。IL-6、IL-17試劑盒(批號(hào):210902,規(guī)格:100T)購(gòu)自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司。

1.2.2標(biāo)本采集和制備

采集觀察組治療前后和對(duì)照組(未接受治療前)患兒清晨空腹外周靜脈血1.5mL,血液樣本經(jīng)EDTA抗凝后于4℃冷藏。密度梯度離心在2h內(nèi)以2 000rpm的速度進(jìn)行20min分離血清,-70℃下保存,用于隨后的細(xì)胞因子檢測(cè)。將外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)懸液濃度調(diào)整為1×106～8/mL,充分混勻后接種到添加RPMI 1640培養(yǎng)液的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板上所有孔細(xì)胞再分別加入PMA(Abcam,50ng/mL)、離子霉素(Abcam,2μg/mL)5μL、莫能菌素(Monensin solution,MS)5μL后混勻,并置于溫箱(37℃,5% CO2條件下)避光孵育5h。

1.2.3細(xì)胞因子IL-6、IL-17的檢測(cè)流程

樣本管中加入 25μL 實(shí)驗(yàn)緩沖液,再加入 25μL樣品血漿后,向所有管中加入25μL捕獲微球抗體(微球加入前充分混勻)和25μL檢測(cè)抗體,室溫避光震蕩孵育 2h(400～500r/min),向所有管中加入 25μL SA-PE,室溫避光震蕩孵育 0.5h(400～500r/min),向每管中加入 1 000μL 1×洗滌緩沖液,渦旋數(shù)秒,400g 離心5min,緩慢倒出液體,倒扣于吸水紙上;向每管中加入 200μL洗滌緩沖液,渦旋 10s 將微球重懸,立即上機(jī)檢測(cè)。樣本檢測(cè)完畢后,保存數(shù)據(jù)源文件至定義的文件夾內(nèi),用分析軟件 LEGENDplex 8.0 分析同批號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和標(biāo)本數(shù)據(jù)后自動(dòng)計(jì)算輸出檢測(cè)結(jié)果(包括 IL-6、IL-17等)。

1.2.4 Th17、Treg細(xì)胞的檢測(cè)流程

按1份細(xì)胞核固定液配3份磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)配制細(xì)胞核固定液,按1份細(xì)胞核破膜液(FOXP3 permea-bilization buffer,FOXP3 PermBuffer)配9份PBS配制FOXP3 PermBuffer工作液。收獲培養(yǎng)板培養(yǎng)的PBMC于流式管中,離心后去上清,用500μL PBS重懸混勻,向所有管加入500μL配制的細(xì)胞核固定液,室溫下避光震蕩孵育0.5h(10～20r/min),離心后棄上清,向所有管加入1mL配制的FOXP3 PermBuffer混勻,3 000rpm,5min離心后去上清,洗滌2次,留300μL液體混勻。其中正常對(duì)照管加300μL PBS混勻后平均分成兩管(一管作為正常對(duì)照管,一管作為同型對(duì)照管)。正常對(duì)照管和樣本管中均加入5μL異硫氰酸熒光素 (fluoresceine isothiocyanate,FITC) 抗人CD4 FITC(anti-human CD4)、5μlPerCP/Cyanine5.5(復(fù)合染料) anti-human IL-17A、5μL藻紅蛋白(P-phycoerythrin,PE)anti-human FOXP3后混勻;同型對(duì)照管分別加入5μL FITC anti-humanCD4、5μL PerCP/Cyanine5.5 Mouse IgG1,κIsotype Ctrl(同型對(duì)照-流式抗體)、5μL PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl(ICFC)(同型對(duì)照-流式抗體)后混勻,所有管室溫下避光震蕩孵育1.5h(10～20r/min)。再向所有管加入1mL配制的FOXP3 PermBuffer,3 000rpm,5min離心后去上清,用PBS重懸并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組一般資料比較

兩組性別構(gòu)成比、母親孕齡、胎齡、體重、1min Apgar評(píng)分、5min Apgar評(píng)分、新生兒發(fā)病時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),兩組具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組資料比較

2.2觀察組與對(duì)照組Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)水平

用兩色熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞因子的水平:用CD4+IL17+標(biāo)識(shí)Th17細(xì)胞,對(duì)照組與觀察組治療前、觀察組治療后的Th17細(xì)胞表達(dá)見(jiàn)圖1。用CD4+FOXP3+標(biāo)識(shí)Treg細(xì)胞,對(duì)照組與觀察組治療前、觀察組治療后的Treg細(xì)胞表達(dá)見(jiàn)圖2。

圖1 觀察組治療前后及對(duì)照組的Th17細(xì)胞表達(dá)圖

圖2 觀察組治療前后及對(duì)照組的Treg細(xì)胞表達(dá)圖

2.3觀察組與對(duì)照組的IL-6、IL-17、Th17、Treg、Th17/Treg表達(dá)水平的差異

觀察組治療前、治療后及對(duì)照組的IL-6、Treg、Th17/Treg差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-6水平:對(duì)照組低于觀察組(Z=-5.030,P<0.05),觀察組治療后低于治療前(Z=-4.050,P<0.05);Treg:觀察組治療后高于治療前(Z=-2.730,P<0.05),觀察組治療前低于對(duì)照組(Z=-2.310,P<0.05)。Th17/Treg:觀察組治療后低于治療前(Z=-2.550,P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 觀察組與對(duì)照組IL-6、IL-17、Th17、Treg、Th17/Treg表達(dá)水平的差異 [M(P25～P75)]

2.4觀察組早產(chǎn)兒治療前后的IL-6、IL-17、Th17、Treg、Th17/Treg表達(dá)水平的差異

觀察組早產(chǎn)兒治療后的IL-6、IL-17、Th17/Treg水平均低于治療前(P<0.05),Treg水平高于治療前(t=-2.440,P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 觀察組早產(chǎn)兒治療前后IL-6、IL-17、Th17、Treg、Th17/Treg表達(dá)水平

2.5觀察組足月產(chǎn)兒治療前后的IL-6、IL-17、Th17、Treg、Th17/Treg表達(dá)水平

觀察組足月產(chǎn)兒治療后的IL-6、Th17/Treg水平均低于治療前(P<0.05),IL-17水平均高于治療前(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 觀察組足月產(chǎn)兒治療前后的IL-6、IL-17、Th17、Treg、Th17/Treg表達(dá)水平 [M(P25～P75),n=39]

2.6觀察組治療前外周血IL-6、IL-17與Th17、Treg表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示:觀察組治療前外周血IL-6與Th17的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.507,P<0.05),見(jiàn)圖3A;觀察組治療前外周血IL-6與Treg的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.336,P<0.05),見(jiàn)圖3B;觀察組治療前外周血IL-17與Th17的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.730,P<0.05),見(jiàn)圖3C;觀察組患兒治療前外周血IL-17與Treg的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性(r=0.101,P>0.05),見(jiàn)圖3D。

注:A.IL-6與Th17表達(dá)水平的相關(guān)性;B.IL-6與Treg表達(dá)水平的相關(guān)性;C.IL-17與Th17表達(dá)水平的相關(guān)性;D.IL-17與Treg表達(dá)水平的相關(guān)性。

3討論

3.1新生兒敗血癥的早期預(yù)警生物學(xué)標(biāo)志物仍然缺乏

新生兒細(xì)菌性敗血癥診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是血培養(yǎng)陽(yáng)性,但其診斷周期較長(zhǎng),一般在2～3d,易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果,故早期診斷異常困難,易誤診或漏診。因此,尋找一種針對(duì)新生兒敗血癥的敏感和特異的生物學(xué)標(biāo)志物作為早期預(yù)警的指標(biāo),對(duì)于該病的早期診斷、治療效果監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷均具有重要的臨床價(jià)值。

3.2 IL-6、Th17和Treg與新生兒敗血癥的以往研究

IL-6是一種重要的促炎因子。Hotoura醫(yī)師研究發(fā)現(xiàn)新生兒敗血癥時(shí)導(dǎo)致新生兒死亡的最主要原因是炎性反應(yīng)失控,而在人體炎性反應(yīng)中最活躍的細(xì)胞因子之一是IL-6。診斷新生兒敗血癥時(shí)IL-6水平較高提示新生兒存在敗血癥可能[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相符,新生兒敗血癥在發(fā)病時(shí)IL-6水平明顯升高,說(shuō)明患兒體內(nèi)炎性反應(yīng)明顯;隨著病情好轉(zhuǎn)患兒血漿IL-6濃度明顯降低,說(shuō)明其體內(nèi)炎性反應(yīng)減弱。

陳碩等[11]研究表明:在分化和維持期間CD4+T細(xì)胞及各種亞型有顯著可塑性;CD4+T細(xì)胞新亞型Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞間也存在很靈活的可塑性。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn):在炎癥因子信號(hào)(如IL-1β、IL-6、IL-21、IL-23)作用下Treg細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化為T(mén)h17細(xì)胞。Ono等[13]研究報(bào)道:在IL-6缺乏時(shí),通過(guò)信號(hào)通路強(qiáng)化FoxP3作用并促進(jìn)Treg細(xì)胞發(fā)育。邢超等[14]研究證實(shí),根據(jù)人胸腺、淋巴結(jié)、扁桃體和外周血中對(duì)Th17、Treg細(xì)胞的檢測(cè),證實(shí)Th17細(xì)胞可產(chǎn)生強(qiáng)烈的致炎效應(yīng),參與多種疾病的促炎癥反應(yīng)。Yan等[15]研究表明Th17和Treg細(xì)胞的不平衡是炎性疾病的特征。

3.3 IL-6、IL-17、Th17、Treg和Th17/Treg與新生兒敗血癥的新發(fā)現(xiàn)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,敗血癥患兒與對(duì)照組比較,發(fā)病初期血漿IL-6、IL-17濃度升高明顯,同時(shí)Treg細(xì)胞比例顯著降低,而且Th17/Treg細(xì)胞比值明顯上升,提示新生兒敗血癥患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈,Th17與Treg細(xì)胞免疫平衡的打破參與患兒疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

觀察組早產(chǎn)兒治療后的IL-6、IL-17、Th17/Treg水平均低于治療前,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組足月產(chǎn)兒治療后的IL-6、Th17/Treg水平均低于治療前,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示早產(chǎn)兒發(fā)生敗血癥更為嚴(yán)重。其他的學(xué)者研究表明IL-6可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化發(fā)育并調(diào)控其功能,而且IL-6抑制Treg細(xì)胞的分化發(fā)育,Treg細(xì)胞可以通過(guò)與Th17細(xì)胞的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的功能[16-19]。本研究結(jié)果顯示,治療前敗血癥新生兒外周血IL-6與Th17的表達(dá)呈正相關(guān),另與Treg細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān);IL-17與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān),而與Treg細(xì)胞比例無(wú)明顯相關(guān)性,提示IL-6參與了敗血癥患兒體內(nèi)免疫平衡穩(wěn)態(tài)的破壞。發(fā)病初期敗血癥患兒Th17比例變化不明顯而其血漿IL-6、IL-17水平明顯增高,推測(cè)發(fā)病初期IL-6水平的變化可能僅僅促進(jìn)Th17細(xì)胞功能增強(qiáng),這還需要后期實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí);本研究顯示與治療前相比,患兒治療后其血漿IL-6、IL-17水平與Th17細(xì)胞比例下降,同時(shí)Treg細(xì)胞比例上升,從而使得Th17/Treg細(xì)胞比值明顯降低,進(jìn)一步證實(shí)新生兒敗血癥患兒IL-6水平的變化導(dǎo)致其體內(nèi)免疫平衡穩(wěn)態(tài)的變化。由此可見(jiàn),隨著新生兒敗血癥的發(fā)生發(fā)展,Th17與Treg細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)發(fā)揮著舉足輕重的作用。此外,對(duì)敗血癥新生兒外周血Th17與Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)炎性因子IL-6等進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),能夠?qū)εR床治療效果進(jìn)行準(zhǔn)確地評(píng)估。

3.4 IL-6、IL-17、Th17、Treg和Th17/Treg參與新生兒敗血癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程的機(jī)制尚待明確

IL-6、IL-17、Th17、Treg和Th17/Treg參與新生兒敗血癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程的機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究,本研究通過(guò)干預(yù)新生兒敗血癥患兒體內(nèi)IL-6水平從而為改善患兒病情提供了一個(gè)新的研究方向。

綜上所述,在新生兒敗血癥的進(jìn)展過(guò)程中,Th17與Treg細(xì)胞免疫平衡穩(wěn)態(tài)的打破與之密切相關(guān)。加強(qiáng)對(duì)敗血癥新生兒外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg細(xì)胞比值及其相關(guān)炎性因子IL-6的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),能夠?qū)π律鷥簲⊙Y的病情及臨床治療效果評(píng)估提供重要依據(jù)。