王勝杰,郭 軍,洪志明,王 全,曾楊玲,陳子龍,邱俊峰,翁浩偉

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510006; 2.深圳市中醫(yī)院男科,廣東 深圳 518033; 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 深圳 518033; 4.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科,北京 100091)

少弱精子癥是當(dāng)前男性不育癥的重要病因之一。目前的研究結(jié)果表明,少、弱精子癥在男性不育癥中占33%,因其發(fā)病機制尚不明確,臨床上亦缺乏確切有效的治療手段[1]。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中,少弱精子癥多屬于“精少”“精薄”等疾病范疇,其核心病機在于腎精虧損,生殖機能減退,導(dǎo)致生精無源。少弱精子癥的中醫(yī)治療以補腎健脾為基本原則,溫養(yǎng)陽氣、滋補精血為重要手段[2]。前期研究結(jié)果表明,蓯蓉益腎顆粒溫陽益腎、滋陰填精、補固腎氣,可以提高精子密度、精子活力及成活率,顯著改善少弱精子癥患者的精子質(zhì)量,具有一定的臨床療效[3]。本研究將基于中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具——BATMAN-TCM在線分析平臺,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,從生物分子水平探討蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機制。

1 資料與方法

1.1 活性成分獲取及靶點預(yù)測

以“肉蓯蓉”“巴戟天”“菟絲子”“五味子”“茯苓”和“車前子”為關(guān)鍵詞,從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索蓯蓉益腎顆粒的藥物成分,并以預(yù)測評分≥25% 、P>0.05為限制條件,篩選出藥物中的活性成分并預(yù)測與活性成分相關(guān)的作用靶點。

1.2 藥物-疾病作用靶點的篩選

以“oligospermia”“asthenospermia”為關(guān)鍵詞,從GeneCards數(shù)據(jù)庫、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM)數(shù)據(jù)庫和PharmGkb數(shù)據(jù)庫中檢索少精子癥與弱精子癥的疾病靶點,利用MLC在線工具將收集到的疾病靶點與“1.1”中得到的藥物作用靶點相互交集,以獲取蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的潛在靶點,并繪制相應(yīng)的韋恩圖。

1.3 靶點間相互作用分析

將獲取到的靶點導(dǎo)入String平臺,物種限定選擇為“人(Homo sapiens)”的選項,并對共有基因構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),然后將綜合得分>0.9的潛在靶點基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape v3.9.0軟件進行圖形化展示,并應(yīng)用CytoNCA、CytoHubba插件,篩選出綜合向心度排序居前10位的靶點基因作為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心靶點。

1.4 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將“1.2”中收集到的蓯蓉益腎顆粒有效成分及成分相關(guān)靶點基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建藥物-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò),節(jié)點與節(jié)點之間的連接代表各因素間的相互作用。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

設(shè)定閾值P<0.05,利用Hiplot可視化平臺對核心靶點基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并繪制柱狀圖與氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分獲取及靶點預(yù)測

從BATMAN-TCM分析平臺中篩選出的預(yù)測作用靶點共701個,與預(yù)測作用靶點相關(guān)的有效成分共101種,其中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、松果菊苷(echinacoside)和類葉升麻苷(acteoside)為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心活性成分。

2.2 藥物作用靶點的篩選

從GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和PharmGkb數(shù)據(jù)庫中檢索少精子癥與弱精子癥的疾病靶點,利用MLC在線工具將3個數(shù)據(jù)庫收集到的疾病靶點取并集后,獲得與少弱精子癥相關(guān)的作用靶點共859個。將上述疾病靶點與“1.1”中獲取到的701個預(yù)測作用靶點相互交集并繪制韋恩圖,最后獲取蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的靶點基因共69個,見圖1、表1。

圖1 蓯蓉益腎顆粒和少弱精子癥的靶點基因韋恩圖Fig 1 Venn diagram of target genes of Congrong Yishen granules and oligospermia and asthenospermia

表1 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的靶點基因Tab 1 Target genes of CRYSG in the treatment of oligospermia and asthenospermia

2.3 靶點間相互作用分析

將獲取的69個靶點基因?qū)隨tring平臺,構(gòu)建共有基因的PPI網(wǎng)絡(luò),見圖2;然后將綜合評分>0.9的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行圖形化展示,見圖3。同時調(diào)用CytoNCA、CytoHubba插件,篩選出綜合向心度排序居前10位的靶點基因作為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心靶點,具體包括胰島素基因(INS)、腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、白細胞介素1β(IL-1β)、基質(zhì)金屬肽酶9(MMP9)、過氧化物酶基因(CAT)、腫瘤蛋白p53(TP53)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、雌激素受體1(ESR1)和干擾素γ基因(IFNG)。

圖2 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network of related targets of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

圖3 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network of core targets of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

2.4 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將“1.2”中收集到的蓯蓉益腎顆粒有效成分及成分相關(guān)靶點基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件,構(gòu)建藥物-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò),見圖4。

紫色原點為藥物-蓯蓉益腎顆粒,綠色原點為有效活性成分,藍色原點為預(yù)測靶點,紅色原點代表疾病-少弱精子癥,黑邊代表靶點間的互相作用關(guān)系the purple point represents the drug-Congrong Yishen granules, and the green points represent the active component. The blue points represent the predicted target, the red points represent the oligospermia and asthenospermia, and the black edges represent the interaction among different targets圖4 蓯蓉益腎顆粒的藥物-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Drug-active component-target-disease network of Congrong Yishen granules

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Hiplot可視化平臺(https://hiplot.com.cn/)對PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG生物通路富集分析,并繪制相應(yīng)的點狀圖和柱狀圖,見圖5。根據(jù)P值(P<0.005)列出前20條GO途徑,蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機制具體涉及類固醇代謝、類固醇激素反應(yīng)、細胞酮代謝及調(diào)控凋亡信號通路等生物分子;KEGG通路富集分析結(jié)果提示,蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機制主要涉及核因子κB(NF-κB)信號通路、甲狀腺激素信號通路、雌激素信號通路及白細胞介素17信號通路等。

3 討論

《辨證錄·種嗣門》中記載:“男不能生子者有六病,一精寒,二氣衰,三精少,四痰多,五相火盛,六氣郁?！逼渲忻鞔_指出少精、弱精(精寒)是男性不育癥的重要病因之一。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中,少弱精子癥多屬于“精少”“精薄”“精清”和“精冷”等疾病范疇,其核心病機在于腎精虧損,生殖機能減退,導(dǎo)致生精無源,男子精少精弱而不育,病因可分虛實,虛則多為先天稟賦不足,或房事不節(jié),或久病及腎;實則飲食不節(jié),或瘀血阻絡(luò),精道不暢等。少弱精子癥的中醫(yī)治療以補腎健脾為基本原則,溫養(yǎng)陽氣、滋補精血為重要手段[4]。蓯蓉益腎顆粒化裁自《太平圣惠方》卷二十六中的“五味子丸”,由肉蓯蓉、巴戟天、菟絲子、五味子、茯苓和車前子6味藥物組成,具有補腎填精的功效,常用于治療腎氣不足、腰膝酸軟、記憶減退、頭暈耳鳴和四肢無力等。方中肉蓯蓉味甘酸咸,性微溫,可滋補元陰、填精益髓,為君藥。巴戟天辛甘,性溫益陽;菟絲子味甘性平,專主男子腎虛精寒,兩者合用,可壯陽強精,共為臣藥。五味子味酸甘,性溫,酸溫以收斂元陽,固護心腎之氣;茯苓味淡性平,功能健脾氣、安心神,兩者共為佐藥。車前子味甘性寒,氣清涼,能泄腎中虛火,并防諸藥滋膩礙脾,為使藥。諸藥合用,共奏滋陰生精、溫陽強精之功,以期溫煦精室,強精生子。前期研究結(jié)果表明,蓯蓉益腎顆粒可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及增加機體代謝,提高精子密度、精子活力及成活率,顯著改善少弱精子癥患者的精子質(zhì)量,具有一定的臨床療效[3]。

A.點狀圖;B.柱狀圖A.scatter diagram; B.bar chart圖5 蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的GO分子功能和KEGG通路富集分析圖Fig 5 GO molecular function and KEGG pathway enrichment analysis of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法及參考相關(guān)文獻,本研究從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索到蓯蓉益腎顆粒的藥物活性成分共101種,總結(jié)其治療少弱精子癥的作用靶點共69個。在蓯蓉益腎顆粒的活性成分中,β-谷甾醇、松果菊苷和類葉升麻苷為蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心活性成分。β-谷甾醇是植物甾醇類成分,屬于四環(huán)三帖類化合物,其廣泛存在于自然界中的各種植物油、堅果等植物種子中,可通過與雌激素受體相結(jié)合,抑制NF-κB的激活,改善促性腺激素釋放激素分泌量減少,繼而促進雄激素的分泌與精子的生成,并提高哺乳動物的精子體外獲能效果[5-6]。松果菊苷是良好的抗氧化成分,能夠清除自由基并且消除氧化應(yīng)激損傷。王鶯等[7]發(fā)現(xiàn),松果菊苷通過提高醋酸鉛中毒模型大鼠睪丸組織內(nèi)乳酸脫氫酶含量,提高超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽水平,進而修復(fù)睪丸組織氧化應(yīng)激損傷情況,提高睪丸組織的抗氧化能力,恢復(fù)睪丸正常的生精功能;Jiang等[8]發(fā)現(xiàn),松果菊苷通過進入下丘腦與雄激素受體靶向結(jié)合,并抑制雄激素受體活性中心,阻斷負反饋調(diào)節(jié),促進正反饋調(diào)節(jié),提高睪酮和促黃體生成素的水平,進而增加哺乳動物的精子數(shù)量。類葉升麻苷是管花肉蓯蓉的提取物之一,馬晶晶等[9]發(fā)現(xiàn),類葉升麻苷可以縮短腎陽虛小鼠模型陰莖勃起潛伏期,增加腎陽虛小鼠模型的精子數(shù)量,顯著提高性器官臟器系數(shù),改善睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu);推測其作用機制可能與調(diào)控生殖激素水平相關(guān),從而改善機體的生精功能[10]。蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用靶點共69個,篩選出綜合向心度排序居前10位的核心靶點有INS、TNF、PTGS2、IL-1β、MMP9、CAT、TP53、ACE、ESR1和IFNG。其中,ESR1的正常表達對男性生殖功能起著重要的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明,ESR1基因mRNA低表達是精液質(zhì)量的危險因素之一[11]。ESR1基因所表達的雌激素受體α可通過配體依賴和非依賴途徑,調(diào)節(jié)精子發(fā)生和精子成熟過程,尤其在調(diào)節(jié)睪丸輸出小管對液體的重吸收中起到重要作用[12-13]。動物實驗結(jié)果顯示,在ESR1基因敲除小鼠模型中,睪丸輸出小管和附睪的微環(huán)境改變,可導(dǎo)致附睪精子濃度和活力降低[12]。丁濤[14]發(fā)現(xiàn),在精子發(fā)生阻滯的不育患者中,ESR1基因在支持細胞表達中下調(diào)。由此可見,改善ESR1基因mRNA低表達,有可能是蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用靶點之一。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),對蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心作用靶點進行GO功能富集分析:(1)生物進程主要體現(xiàn)在促進類固醇和細胞酮代謝過程,增強細胞對類固醇激素的反應(yīng),增強類固醇生物合成的過程,并體現(xiàn)在對細胞凋亡信號通路的負調(diào)控;(2)細胞組成提示,靶點主要作用于細胞的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)運復(fù)合物、離子通道復(fù)合物、鈉通道復(fù)合物、高爾基體、髓鞘和T小管等部位;(3)分子功能主要體現(xiàn)在對配體門控鈉離子通道活性、核受體活性、類固醇羥基酶活性、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性、3′,5′-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性和3′,5′-環(huán)-AMP磷酸二酯酶活性的調(diào)控。對核心靶點進行KEGG通路富集分析,結(jié)果提示:蓯蓉益腎顆粒所調(diào)節(jié)的分子功能主要涉及類固醇生物合成途徑、NF-κB信號通路、雌激素信號通路和白細胞介素17信號通路等。其中類固醇生物合成途徑是蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的核心通路之一。精子的發(fā)生、獲能離不開雄激素的調(diào)控。雄激素是類固醇化合物,與雄激素結(jié)合蛋白相結(jié)合時,使生精小管中的雄激素集中濃縮于管腔中,以刺激生精小管生成精子,同時可以促進精子的成熟,保持精子的活力[15]。王啟新[10]發(fā)現(xiàn),肉蓯蓉通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,維持下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)激素水平的穩(wěn)定,促進睪酮的分泌和釋放,增加小鼠的睪丸及其副性腺器官的重量,進而改善小鼠的生殖能力。相關(guān)研究報道,肉蓯蓉中所含的苯乙醇苷能夠促進雄激素的分泌,從而提高精子質(zhì)量,改善生殖功能[16]。以此推測,蓯蓉益腎顆粒可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌軸的功能,促進雄性激素和促性腺激素的分泌,改善睪丸生精功能,以此起到治療少弱精子癥的作用。同時,蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥涉及NF-κB信號通路。NF-κB信號通路在細胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起到關(guān)鍵性作用[17]。邱嫻嫻等[18]發(fā)現(xiàn),PM2.5可通過誘導(dǎo)NF-κB炎癥信號通路激活,上調(diào)白細胞介素6、TNF-α等炎癥因子的表達,放大炎癥級聯(lián),造成睪丸組織的炎性損傷,從而導(dǎo)致雄性大鼠生殖功能障礙。葉臻等[19]發(fā)現(xiàn),通過激活NF-κB通路,提高NDRG2炎癥因子水平,可引起純睪丸支持細胞綜合征患者的睪丸中間質(zhì)細胞的大量凋亡。由此推測,蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的作用機制,有可能是通過抑制NF-κB信號通路激活,下調(diào)相關(guān)炎癥因子的水平,改善睪丸及附睪的炎癥損害,以達到治療的目的[20]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法,對蓯蓉益腎顆粒治療少弱精子癥的分子作用機制進行了探討,同時也說明了中藥復(fù)方治療疾病具有多成分、多靶點、多通路的特點,體現(xiàn)了中藥復(fù)方的整體性和獨特性,為后續(xù)進一步的實驗研究、探討蓯蓉益腎顆粒治療疾病的作用機制提供了理論支持。