田 捷,余黃琴,周 敏,郭 龍,劉 飛

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科,南昌 330006; 2.九江市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科,江西 九江 332000)

腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)是腎細(xì)胞癌中最常見(jiàn)的病理分型,其最有效的治療方法仍是手術(shù)干預(yù)[1-2]。目前,KIRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不明確,KIRC相關(guān)的基礎(chǔ)研究對(duì)未來(lái)KIRC的臨床診療水平的進(jìn)步有重要意義。微小RNA(miRNA)屬于非編碼RNA,有些miRNA可以與目標(biāo)基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合,以此在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá),miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。有研究[4-9]表明,許多miRNA作為腫瘤抑制因子在人類(lèi)癌癥發(fā)生中發(fā)揮作用,例如miR-144-3p在肺癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌中表達(dá)水平降低,它可作為腫瘤抑制因子與下游靶基因結(jié)合抑制腫瘤的進(jìn)展。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的主要功能是對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),其功能的變化影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[10-11]。E2F8是新發(fā)現(xiàn)的E2F家族成員,其在KIRC中的生物學(xué)功能和臨床轉(zhuǎn)化意義尚未被研究,但是TargetScan軟件預(yù)測(cè)(https://www.targetscan.org)E2F8存在與miR-144-3p的結(jié)合位點(diǎn),提示E2F8的表達(dá)可能受miR-144-3p的調(diào)節(jié)。本研究旨在探究miR-144-3p和E2F8在KIRC中的表達(dá)情況,并對(duì)其相互作用對(duì)KIRC細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控產(chǎn)生的影響展開(kāi)研究,以期為KIRC的早期診斷和治療手段開(kāi)發(fā)提供新的線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

腎小管上皮細(xì)胞系HK-2和KIRC細(xì)胞系786-O,ACHN和OS-RC-2均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;澳洲胎牛血清(FBS)、TransIntro?EL轉(zhuǎn)染試劑、Trizol總RNA抽提試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;熒光素酶試劑盒購(gòu)自南昌聚焦生物科技有限公司;兔源多克隆E2F8抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;CCK8試劑和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物公司。

收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科2021年4月至2021年11月進(jìn)行的10例腹腔鏡下腎癌根治術(shù)中獲取的腎癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本,保存于液氮中備用。

納入標(biāo)準(zhǔn):患者術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診腎透明細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前接受免疫治療或其他治療者。本研究已取得患者的知情同意,并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)HK-2、786-O、OS-RC-2細(xì)胞,采用含10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ACHN細(xì)胞,并置于37 ℃、5%CO2的無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱中。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR

使用Trizol提取細(xì)胞和組織的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板后,使用熒光定量PCR試劑盒配置反應(yīng)體系,在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)miR-144-3p和E2F8 mRNA的表達(dá)水平。miR-144-3p上引物5′-GGCCGGCGTACAGTATAGATGA-3′;下引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內(nèi)參基因U6上引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。E2F8上引物:5′-CCTGAGATCCGCAACAGA-GA

T-3′;下引物:5′-AGATGTCATTATTCACAGCAGGG-3′。內(nèi)參基因GAPDH上引物:5′- AACGGATTTGGCCGTATTGG-3′;下引物:5′-CATTCTCGGCCTTGACTGTG -3′。反應(yīng)條件:95 ℃ 34 s,60 ℃ 5 s,72 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 蛋白免疫印跡

將細(xì)胞在RIPA裂解液中裂解,并用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將總蛋白樣品加入預(yù)制的SDS-PAGE凝膠,進(jìn)行常規(guī)電泳后并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)上。用5%脫脂牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉處理1 h,用TBST清洗1次,4 ℃下孵育一抗過(guò)夜。用TBST清洗3次,每次10 min,然后在室溫下孵育二抗2 h。用TBST清洗3次,每次10 min,用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行熒光顯色,用成像系統(tǒng)拍照并分析目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞,用胰酶消化后接種到新6孔板中,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度60%～70%時(shí),遵循TransIntro?EL轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將minic miR-144-3p載體及空白對(duì)照載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,分別標(biāo)記為miR-144-3p組和miR-NC組。轉(zhuǎn)染后6 h,更換為含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48 h,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

采用上述轉(zhuǎn)染方法,將786-O細(xì)胞分為si-E2F8組(轉(zhuǎn)染si-RNA的表達(dá)載體,沉默E2F8表達(dá))、si-NC組(轉(zhuǎn)染空載體,作為si-E2F8組的陰性對(duì)照)、anti-miR-144-3p組(轉(zhuǎn)染miR-144-3p表達(dá)的干擾載體)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染空載體,作為anti-miR-144-3p組的陰性對(duì)照)、 miR-144-3p+pcDNA-E2F8組(minic miR-144-3p載體與E2F8過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染)和miR-144-3p+pcDNA組(minic miR-144-3p載體與pcDNA空載共轉(zhuǎn)染,作為miR-144-3p+pcDNA-E2F8組的陰性對(duì)照)。

1.2.5 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

以104個(gè)·孔-1的密度將細(xì)胞接種于96孔板,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,并置于37 ℃、5% CO2的無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)60%;分別于生長(zhǎng)0、24、48、72 h時(shí),在不同的孔內(nèi)加入10 μL的CCK8試劑,0.5 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

以3×105個(gè)·孔-1的密度將細(xì)胞種植于6孔板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,依照PI-APC試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞。用緩沖液重懸細(xì)胞,輕搖至均勻,孵育20 min。加入適量PI-APC,避光孵育30 min,上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-144-3p與E2F8存在結(jié)合位點(diǎn),E2F8可能是miR-144-3p的一個(gè)靶基因。構(gòu)建野生型E2F8(Wild-E2F8)和突變型E2F8(Mutant-E2F8)的質(zhì)粒,按照1.2.4方法將空白對(duì)照載體和minic miR-144-3p載體分別與Wild-E2F8和Mutant-E2F8共轉(zhuǎn)染,并置于37 ℃、5% CO2無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞,按照熒光素酶基因報(bào)告試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0和GraphPad Prism8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIRC細(xì)胞系和組織中miR-144-3p和E2F8的表達(dá)情況

與腎小管上皮細(xì)胞系HK-2相比,KIRC細(xì)胞系786-O、ACHN和OS-RC-2中miR-144-3p表達(dá)水平均較低(P<0.001,圖1A),而E2F8蛋白和mRNA表達(dá)水平均較高(P<0.05、P<0.01和P<0.001,圖1A-B)。與癌旁組織相比,腎透明細(xì)胞癌組織中miR-144-3p表達(dá)水平較低(P<0.001),而E2F8 mRNA表達(dá)水平較高(P<0.01)。見(jiàn)圖1C。

A:miR-144-3p和E2F8在腎小管上皮細(xì)胞和腎癌細(xì)胞系中的表達(dá);B:E2F8蛋白在腎小管上皮細(xì)胞和腎癌細(xì)胞系中的表達(dá);C:miR-144-3p和E2F8在腎透明癌細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-144-3p抑制786-O細(xì)胞的增殖

miR-144-3p組786-O細(xì)胞中miR-144-3p水平顯著高于miR-NC組(P<0.05),說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-144-3p的786-O細(xì)胞株構(gòu)建成功,且其miR-144-3p組細(xì)胞中E2F8 mRNA的表達(dá)水平顯著下降(P<0.001)。與miR-NC組相比,miR-144-3p組細(xì)胞周期蛋白CCND1的表達(dá)量明顯降低,P27和P21的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);miR-144-3p組786-O細(xì)胞增殖能力較miR-NC組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A:過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)786-O細(xì)胞E2F8表達(dá)水平影響。*P<0.05,***P<0.001。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-144-3p促進(jìn)786-O細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,與miR-NC組相比,miR-144-3p組中凋亡細(xì)胞占比顯著增多(P<0.001)(圖3A)。并且,與miR-NC組相比,miR-144-3p組凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯降低,而B(niǎo)ax和Caspase-3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3B。

A:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;B:過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)786-O細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響。*P<0.05,***P<0.001。

2.4 沉默E2F8表達(dá)抑制786-O細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡

沉默E2F8表達(dá)的786-O細(xì)胞株(si-E2F8組)細(xì)胞增殖能力較si-NC組顯著降低(P<0.01)(圖4A)。與si-NC組相比,si-E2F8組細(xì)胞周期蛋白CCND1的表達(dá)量顯著降低,P21蛋白表達(dá)量則顯著升高(P<0.05)。與si-NC組相比,si-E2F8組凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低,而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4B。

2.5 miR-144-3p可靶向抑制E2F8的表達(dá)

TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,E2F8是miR-144-3p的潛在靶基因,miR-144-3p和E2F8 mRNA的3′UTR之間存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。與miR-NC+Wild-E2F8共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,mimic miR-144-3p+Wild-E2F8共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光素酶活性明顯下降(P<0.001),而miR-NC+Mutant-E2F8和miR-144-3p+Mutant-E2F8共轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖5B。與miR-NC相比,miR-144-3p組中E2F8蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),而anti-miR-144-3p組中E2F8蛋白表達(dá)水平較anti-miR-NC組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5C。

A:has-miR-144-3p與E2F8互補(bǔ)的核苷酸序列;B:雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-144-3p與E2F8 mRNA的相互作用;C:Western印跡檢測(cè)E2F8的表達(dá)。*P<0.05,***P<0.001。

2.6 過(guò)表達(dá)E2F8逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)786-O細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與miR-144-3p+pcDNA組相比,轉(zhuǎn)染后miR-144-3p+pcDNA-E2F8組786-O細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6A。與miR-144-3p+pcDNA組相比,miR-144-3p+pcDNA-E2F8組CCND1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高,而P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖6B。

A:過(guò)表達(dá)E2F8逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)786-O細(xì)胞增殖能力的抑制作用;B:過(guò)表達(dá)E2F8逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)786-O細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)的作用。*P<0.05。

3 討論

由于早期癥狀的隱匿性和有效早期診斷方法的缺乏,許多新確診的腎透明細(xì)胞癌的患者已經(jīng)處于疾病晚期,通常伴有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致預(yù)后不良[12]。因此需要尋找KIRC治療的新方案來(lái)改善患者預(yù)后。研究表明miRNAs與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可以通過(guò)調(diào)控下游分子的表達(dá)水平參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程,并可作為癌癥的預(yù)后指標(biāo),所以鑒定腫瘤相關(guān)miRNA并預(yù)測(cè)其下游分子是相關(guān)研究中至關(guān)重要的內(nèi)容[13-14]。miR-144-3p的編碼基因位于11號(hào)染色體上,包含一個(gè)非編碼轉(zhuǎn)錄單元,該轉(zhuǎn)錄單元也編碼miR-451[15]。有研究[4-9]證明miR-144-3p在腫瘤發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色,與其靶向基因mRNA之間的相互作用影響著諸多腫瘤生物學(xué)過(guò)程。

在本研究通過(guò)TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-144-3p和E2F8之間的互作關(guān)系,得出E2F8可能是miR-144的下游靶基因。已有研究[16-18]指出E2F8在人類(lèi)黑色素瘤、卵巢癌、肝細(xì)胞癌和肺癌中過(guò)表達(dá),并證實(shí)E2F8過(guò)表達(dá)與卵巢癌的組織病理學(xué)進(jìn)展相關(guān)。還有報(bào)道[19]證明E2F8促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,幫助其建立抗藥性和侵襲性,可能是肝細(xì)胞癌和肺癌的潛在治療靶點(diǎn)。有研究[20]通過(guò)上調(diào)E2F8的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞增殖和致瘤能力。以上數(shù)據(jù)表明,E2F8可能作為miR-144-3p的下游靶基因,在癌癥的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn),與腎小管上皮細(xì)胞HK2相比,KIRC腫瘤細(xì)胞786-O、ACHN、OS-RC-2中miR-144-3p表達(dá)水平顯著降低,并與E2F8表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),在收集到的KIRC組織標(biāo)本中也得出了同樣結(jié)果。上調(diào)miR-144-3p的表達(dá)可以抑制786-O細(xì)胞增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡,而沉默E2F8的表達(dá)也可以達(dá)到同樣性質(zhì)的效果。過(guò)表達(dá)E2F8可以逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)KIRC細(xì)胞系786-O的增殖抑制和調(diào)控促進(jìn)作用。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證明miR-144-3p和E2F8 mRNA之間存在相互作用,miR-144-3p對(duì)KIRC中的抑制作用是通過(guò)與E2F8 mRNA 的3′-UTR結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控E2F8表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明E2F8是miR-144-3p下游靶基因,miR-144-3p可以通過(guò)靶向調(diào)控E2F8基因抑制KIRC腫瘤細(xì)胞786-O的增殖、促進(jìn)其細(xì)胞凋亡,且miR-144-3p和E2F8表達(dá)的組合可能是KIRC患者預(yù)后的高敏感度標(biāo)志物。

本研究在體外細(xì)胞系中驗(yàn)證了miR-144-3p與靶基因E2F8的作用,但仍待動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。同時(shí),需要進(jìn)一步挖掘miR-144-3p在KIRC中可能發(fā)揮的其他功能以及與E2F8相關(guān)的信號(hào)通路,以明確其具體作用機(jī)制。