趙帥帥,顏 諾,李曉貴,吳起才,周學(xué)亮

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科,南昌 330006)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是由肺動脈壓力進行性升高所引起的一系列嚴重的心血管疾病,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升[1-2]。PH的發(fā)病機制與遺傳、環(huán)境和生物學(xué)等多個因素有關(guān),然而,PH的病因尚未被完全闡明。因此,探索PH發(fā)病的細胞基礎(chǔ)和分子機制,探索新的治療靶點對其臨床治療具有重大的意義。隨著RNA修飾領(lǐng)域的研究不斷取得進展,代謝和表觀遺傳學(xué)之間的串擾在基因表達、細胞增殖和分化中起的關(guān)鍵作用逐漸清晰。特別是N6-甲基腺苷(m6A)修飾因其在調(diào)控基因表達和細胞命運決定過程中發(fā)揮的重要作用受到了人們的廣泛關(guān)注。RNA m6A修飾可能與PH的形成有關(guān),并且m6A結(jié)合蛋白YTHDF2在該過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。為了更好地認識這些新發(fā)現(xiàn),本綜述將對m6A修飾、YTHDF2和EGFR在PH發(fā)病機制中的作用進行系統(tǒng)性的介紹和探討。

1 PH的研究現(xiàn)狀

PH的主要組織病理學(xué)特征是血管壁的重塑,包括內(nèi)膜增生、中膜肥厚、外膜纖維化和細胞外基質(zhì)沉積,這些變化綜合導(dǎo)致了肺動脈管腔進行性狹窄、閉塞,肺動脈內(nèi)皮細胞(pulmonary arterial endothelial cells,PAECs)、肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)在該病理過程中具有重要作用,PASMCs的過度增殖是肺動脈重構(gòu)的主要特征[3]。

PH的發(fā)病機制復(fù)雜,涉及多種生物學(xué)過程,包括血管活性分子分泌、離子通道調(diào)節(jié)、凋亡抵抗、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和免疫失調(diào)等[4]。目前正在被研究的參與PH疾病發(fā)生的信號通路包括MAPK/MK2通路、Hippo-YAP/PI3K/AKT通路、NF-κB/TNF-α通路、Src/EGFR/NOX2通路、AK4/HIF-1α通路、EGFR/ERK通路、SEDT2/METTL14通路、METTL3/YTHDF2/PTEN通路和Notch通路等[3-11]。

PH的治療方案包括一般治療、藥物治療和手術(shù)治療。其中,一般治療主要指活動和康復(fù)指導(dǎo),抗凝藥物、利尿劑和心血管活性藥物治療,氧氣治療,改善貧血和補鐵治療以及社會心理支持等。藥物治療則包括鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers,CCB)、內(nèi)皮素受體拮抗劑(endothelin receptor antagonists,ERA)、5-磷酸二酯酶抑制劑、鳥苷酸環(huán)化酶激動劑(guanylate cyclase stimulators,sGC)、前列環(huán)素類似物和前列環(huán)素受體激動劑[12]。以上藥物雖然可以改善PH患者的癥狀,但其長期預(yù)后仍然較差,病死率較高。因此,新藥物和治療方案的研發(fā)成為PH研究中的重點領(lǐng)域。

2 EGFR在PH中的作用

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶受體,由細胞外配體結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)酪氨酸激酶受體結(jié)構(gòu)域組成,對包括細胞增殖和血管生成在內(nèi)的多種生物過程起重要調(diào)節(jié)作用[6]。有研究[9]表明人肺微血管內(nèi)皮細胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,hPMVECs)增殖依賴于EGFR的激活。增殖的PMVECs釋放多種生長因子和趨化因子,包括精氨酸酶-2(arginase-2,Arg-2)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、趨化因子(C-X-C chemokine ligand12,CXCL12)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)[13],這些因子共同促進PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)[14]。另有研究[15]證明來自PH患者的PASMCs比來自健康人的對生長因子更敏感,EGFR過度表達是導(dǎo)致PH患者PASMCs過度增殖的重要原因。同時,免疫組織化學(xué)實驗檢測到在缺氧和野百合堿 (monocrotaline,MCT) 誘導(dǎo)的PH模型中的肺血管壁EGFR表達增加,主要分布在PASMCs中。

有研究表明[16]EGFR促進泡沫細胞轉(zhuǎn)化,并加速以平滑肌細胞和巨噬細胞積累為特征的動脈粥樣硬化病變。有研究者[17]證實缺氧導(dǎo)致了核蛋白亞細胞分布的改變,顯著促進了EGFR信號的激活,EGFR的磷酸化修飾增強了血管細胞對Ca2+的敏感性,導(dǎo)致血管收縮作用增強以及肺血管重構(gòu)發(fā)生發(fā)展[18]。而注射EGFR抑制劑可以改善MCT誘導(dǎo)的PH大鼠的肺動脈重構(gòu)[17-18]。上述研究結(jié)果表明EGFR的異常激活是PASMCs、PMVECs增殖、遷移和存活的重要原因,因此,EGFR信號通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)對肺血管功能的維持十分重要,也是治療PH的潛在靶點。

EGFR可以激活下游細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)[19],ERK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成員,ERK/MAPK信號通路已被證明對多種細胞的生存和增殖過程至關(guān)重要。缺氧處理誘導(dǎo)EGFR激活導(dǎo)致ERK的磷酸化,從而促進細胞增殖[9]。同時磷酸化的ERK可以激活缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)[20],HIF-1是一種由α亞基和β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。激活后的HIF-1α亞基積累并轉(zhuǎn)移到細胞核,與HIF-1β結(jié)合形成異源二聚體,激活并轉(zhuǎn)錄與能量代謝、細胞增殖、凋亡和細胞外基質(zhì)重組有關(guān)的基因[21]。HIF-1的過表達也將促進PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)[22]。綜上所述,EGFR激活是PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)過程中的關(guān)鍵信號。

3 m6A修飾及其結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性

RNA修飾包括甲基化、磷酸化、乙?；然瘜W(xué)修飾,N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核生物mRNA中最豐富的堿基修飾,mRNA的m6A修飾與多種細胞過程密切相關(guān)[23]。m6A主要分布于mRNA的開放閱讀框(ORF)[24-25]、3′-非翻譯區(qū)(UTRs)和終止密碼子附近[26]。mRNA甲基化修飾受甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶以及甲基化結(jié)合蛋白的動態(tài)調(diào)控以維持基因的正常表達,其中所涉及的調(diào)控因子有:甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物METTL3 /METTL14/WTAP,其中METTL3是核心酶,METTL14在體內(nèi)與METTL3形成穩(wěn)定的異二聚體,WTAP可以與METTL3和METTL14形成復(fù)合物重新組裝成泛甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物,共同催化m6A甲基化。去甲基化酶ALKBH5和FTO負責(zé)催化去甲基化作用,m6A結(jié)合蛋白識別mRNA的目標區(qū)域并與之結(jié)合以實現(xiàn)相應(yīng)的功能(詳見表1)[27]。

表1 m6A調(diào)節(jié)因子在RNA代謝中的功能

m6A結(jié)合蛋白的YTH結(jié)構(gòu)域由134個氨基酸組成[28],YTH結(jié)構(gòu)域蛋白包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2,YTHDC蛋白通常局限于細胞核,而YTHDF蛋白主要存在于細胞質(zhì)中,已有證據(jù)[29]表明它們調(diào)控mRNA的加工、翻譯和降解過程。YTHDF1通過與翻譯起始因子和核糖體相互作用來增強翻譯;YTHDF2通過與靶mRNA結(jié)合,促進其降解;YTHDF3與YTHDF1和YTHDF2相互作用[27],協(xié)助調(diào)控mRNA的翻譯和降解。m6A結(jié)合蛋白相互作用,共同控制細胞內(nèi)RNA的穩(wěn)定、剪切和翻譯,從而影響基因表達調(diào)節(jié)和相關(guān)疾病的發(fā)生。m6A的失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病和代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展,如何維持上述分子表達和功能水平處于穩(wěn)態(tài),是預(yù)防血管異常增生和血壓升高的關(guān)鍵。

4 m6A結(jié)合蛋白YTHDF2對EGFR mRNA的調(diào)控

m6A修飾在細胞中的作用是通過多種機制介導(dǎo)的,通過影響mRNA的轉(zhuǎn)運、降解、翻譯和代謝,參與多種病理生理過程。在干細胞中,m6A修飾通過改變mRNA的穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)干細胞的分化[25]。已有研究[3,10]證明m6A修飾影響PH病理生理過程中多個特定基因的表達水平,METTL3、METTL14參與調(diào)節(jié)PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)。在哺乳動物YTH蛋白家族中,YTHDF2已被證明通過CCR4-NOT復(fù)合物的去烯基化[30],或HRSP12-RNaseP/MRP7-9復(fù)合物來破壞mRNA穩(wěn)定性[31],從而影響細胞的自我更新和分化過程。在細胞質(zhì)內(nèi),YTHDF2在正常和應(yīng)激條件下促進了m6A依賴的mRNA的降解[32]。

近期研究[28-30]表明m6A及其結(jié)合蛋白YTHDF2均參與PH的發(fā)生發(fā)展,并影響EGFR mRNA水平,進而影響疾病進展。值得注意的是,m6A結(jié)合蛋白YTHDF2可以選擇性地識別和結(jié)合m6A修飾的RNA,并對相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和降解發(fā)揮關(guān)鍵作用。在YTHDF2的干預(yù)下,EGFR mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和穩(wěn)定性發(fā)生了變化,這影響了PH的發(fā)病過程。LI等[16]的研究也表明m6A介導(dǎo)了EGFR mRNA降解,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞功能障礙。另有一項肝癌研究[33]的數(shù)據(jù)也顯示YTHDF2通過結(jié)合EGFR 3′-UTR的m6A修飾位點,加速EGFR的降解來抑制ERK/MAPK通路和細胞增殖,影響肝癌的進展。

研究已經(jīng)表明在PH模型的PASMCs、PMVECs中EGFR過表達[9,15],EGFR mRNA的穩(wěn)定性受m6A級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控。筆者的研究團隊據(jù)此推測,EGFR mRNA在PMVECs的胞質(zhì)中生成并獲得m6A修飾,在缺氧環(huán)境中YTHDF2表達上調(diào),影響EGFR mRNA的穩(wěn)定性,而EGFR磷酸化后可以激活ERK/MAPK通路,誘使HIF-1α轉(zhuǎn)移到細胞核與HIF-1β結(jié)合形成異源二聚體,通過旁分泌方式分泌細胞因子促進PAECs增殖,并促使PAECs分泌ET-1,ET-1被PASMCs攝入并內(nèi)化后,通過調(diào)控其細胞內(nèi)Ca2+濃度和下游靶基因mRNA和蛋白的表達,調(diào)控PASMCs的增殖、凋亡等細胞過程,參與PH的病理變化(機制流程示意見圖1)。

圖1 YTHDF2通過調(diào)控EGFR mRNA 影響PH發(fā)展的機制假設(shè)

5 總結(jié)與展望

PH是一種進行性加重的心血管疾病,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,目前無法根治。RNA的m6A修飾參與了PH發(fā)病機制的調(diào)控,YTHDF2作為m6A“讀取器”蛋白家族的主要成員之一,通過調(diào)控EGFR mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄水平來影響PH的發(fā)生和發(fā)展,因此,探討m6A結(jié)合蛋白YTHDF2對EGFR mRNA的調(diào)控機制對PH治療有著重要的意義。

PASMCs和PAECs的過度增殖和凋亡抵抗直接導(dǎo)致了PH患者的肺血管重構(gòu),EGFR在其中的作用不可忽視。YTHDF2/EGFR參與調(diào)控細胞凋亡、增殖、遷移等過程,很可能通過與ERK/MAPK、HIF-1α、ET-1、Ca2+等因子相互作用,構(gòu)成了一個多通路、多層次的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò),介導(dǎo)了肺血管重構(gòu)的發(fā)生。關(guān)于EGFR在各種疾病中作用的研究僅揭開了其機制的冰山一角,而對PH中EGFR角色的研究才剛剛開始。