趙利娟,趙 榮,張 俏,何 悅,許 璐,王四旺,肖會敏*

1.陜西中藥研究所(陜西醫(yī)藥信息中心),咸陽 712000;2.陜西海天制藥有限公司,咸陽 712000;3.陜西省中藥與天然藥物研發(fā)重點實驗室,西安 710075;4.陜西含光生物科技有限公司,西安 710032;5. 西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部,西安 710069

手足口病多發(fā)于嬰幼兒,是一種常見的病毒性傳染病[1]。腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是導(dǎo)致手足口病重癥及死亡的主要病毒,可造成神經(jīng)細胞、T淋巴細胞及人血管內(nèi)皮細胞凋亡[2-3],甚至導(dǎo)致腦炎、腦水腫、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等疾病。近年來,該病毒嚴重威脅學(xué)齡前兒童的健康。由陜西海天制藥有限公司生產(chǎn)的四季抗病毒合劑(Siji Kangbingdu Mixture,SJM)具有清熱解毒、消炎退熱的功效,可用于治療上呼吸道感染、病毒性感冒、手足口病等。臨床研究報道,SJM治療兒童手足口病療效顯著[4-5],甚至優(yōu)于利巴韋林[6-7]。連翹酯苷A、連翹酯苷B、連翹苷、甘草苷、甘草酸、木犀草苷、綠原酸、1,3-二咖啡?？鼘幩?、3,5-二咖啡?？鼘幩崾荢JM的主成分(principal component,PC),也是主要功效成分[8-9]。盡管目前的EV71滅活疫苗可預(yù)防手足口病,但仍無特效治療藥物。因此,研制高效、低毒的抗EV71藥物是對抗手足口病的關(guān)鍵。本研究旨在探討SJM及其PC抗EV71增殖和感染的作用及其潛在機制,為手足口病的臨床治療提供依據(jù),為老藥新用奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Multiskan FC微孔板讀數(shù)儀、1300 Series A2型Thermo ScientificTM生物安全柜均購自美國Thermo Scientific公司;MKS-112型獨立通風(fēng)籠盒系統(tǒng)(蘇州市猴皇動物實驗設(shè)備科技有限公司);D180-P型二氧化碳培養(yǎng)箱(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);CKX53倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 試藥

四季抗病毒合劑(國藥準字Z20027669,批號181226)由陜西海天制藥有限公司生產(chǎn),每瓶含原生藥174.6 g(0.97 g·mL-1×180 mL),臨用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度;PC組成見表1,連翹酯苷A(批號111810-201606)、連翹酯苷B(批號111811-201603)、綠原酸(批號110753-201716)、連翹苷(批號110821-201615)、甘草苷(批號111610-201607)、甘草酸(批號110731-201619)、木犀草苷(批號111720-201609)、1,3-二咖啡酰奎寧酸(批號111717-201402)、3,5-二咖啡酰奎寧酸(批號111782-201405),均購自中國食品藥品檢定研究院;細胞培養(yǎng)及動物腹腔注射用試藥均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除菌;利巴韋林注射液(國藥準字H19999077,批號1805198,規(guī)格為每支0.1 g×1 mL),由陜西頓斯制藥有限公司生產(chǎn),臨用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司;MTS 細胞增殖定量檢測試劑盒購自美國Promega公司;二甲基亞砜、溴化二甲噻唑二苯四氮唑均購自美國Sigma公司;9 mg·mL-1氯化鈉溶液購自陜西圣奧動物藥業(yè)有限公司。

表1 SJM的PC組成

1.3 實驗動物

7日齡SPF級ICR乳鼠,購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(陜)2014-002;動物實驗操作遵守中國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》(國科發(fā)財字[2006]398號)。

1.4 細胞與病毒株

非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心;腸道病毒71型(EV71)購于美國典型菌種保藏中心。

2 方法

2.1 細胞病變效應(yīng)法測定EV71毒力及EV71 RNA檢測

取適量EP管,分別加入90 μL無血清DMEM培養(yǎng)基。將準備好的EV71原液吹打混勻后吸取10 μL置于1號EP管中(稀釋10-1),吹打混勻后從中吸取10 μL置于2號管(稀釋10-2),以此類推逐個稀釋至8號管(稀釋10-8)。將各稀釋度的病毒一次接種至已長好Vero細胞的96孔板中,同時設(shè)置空白組和正常組,每組沿縱向設(shè)置6個復(fù)孔,置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞病變效應(yīng)。當(dāng)細胞病變效應(yīng)達90%以上時終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,逐孔加入溴化二甲噻唑二苯四氮唑溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液并加入二甲基亞砜,待沉淀結(jié)晶完全溶解后,用酶標儀于490 nm處測定吸光度(A)值,計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50):細胞存活率=[(病毒組A值-空白組A值)/(正常組A值-空白組A值)]×100%;細胞比距=[(高于50%病變率-50%)/(高于50%病變率-低于50%病變率)]×100%;TCID50=Antilg(lg高于50%細胞病變效應(yīng)百分率病毒稀釋度+比距×稀釋因子對數(shù))。

當(dāng)細胞病變效應(yīng)達到75%以上時收集病毒裂解液,提取EV71的RNA,經(jīng)RT-RCR法檢測。步驟參考相關(guān)文獻進行[10],反應(yīng)結(jié)束后,取PCR反應(yīng)產(chǎn)物,用瓊脂糖凝膠電泳檢測病毒的目的片段。

2.2 SJM與PC對Vero細胞的毒性

MTS法測定:將Vero細胞接種于96孔板中,每孔細胞數(shù)為1×104個,對照組加入等量DMEM培養(yǎng)基,四季抗病毒合劑組(按生藥量計為97.00、48.50、24.25、12.13、6.07、3.04、1.52、0.76、0.38 mg·mL-1)、PC組(按連翹酯苷A計為0.17、0.085、0.042 5、0.021 25、0.010 6、0.005 31、0.002 66、0.000 66 mg·mL-1)按劑量分組處理,每組10個復(fù)孔,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,按說明書操作,用酶標儀于490 nm處測定A,計算各給藥組的細胞存活率。

2.3 SJM與PC對ICR乳鼠的急性毒性

取7日齡ICR乳鼠72只,將其隨機分為6組,分別為單次對照組(腹腔注射氯化鈉溶液0.1 mL)、連續(xù)對照組(腹腔注射氯化鈉溶液0.1 mL,每日1次,連續(xù)給藥15 d)、四季抗病毒合劑單次組[腹腔注射32.32 g·kg-1SJM(按生藥量計)0.1 mL]、四季抗病毒合劑連續(xù)組(腹腔注射32.32 g·kg-1SJM 0.1 mL,每日1次,連續(xù)給藥15 d)、PC單次組[腹腔注射56.64 mg·kg-1PC(按連翹酯苷A計)0.1 mL]、PC連續(xù)組(腹腔注射56.64 mg·kg-1PC 0.1 mL,每日1次,連續(xù)給藥15 d),每組12只。觀察并記錄每只乳鼠的精神狀態(tài)、行為、飲食、死亡等情況。

2.4 SJM與PC體外抗EV71活性

參照文獻方法[11],將Vero細胞隨機分為32組,每組5個復(fù)孔,分別為正常組、模型組(感染75 TCID50與50 TCID50EV71的Vero細胞)、四季抗病毒合劑組(感染75 TCID50與50 TCID50EV71的Vero細胞給藥劑量按生藥量計為4 850、2 430、1 220、610、300、150、80 μg·mL-1)、PC組(感染75 TCID50與50 TCID50EV71的Vero細胞給藥劑量按連翹酯苷A計為8.50、4.25、2.13、1.06、0.53、0.27、0.13 μg·mL-1)。

2.5 SJM與PC體內(nèi)抗EV71活性

將156只ICR乳鼠隨機分為13組,每組12只,模型乳鼠腹腔注射毒力為1×107TCID50·mL-1的EV71 0.1 mL(參照文獻方法造模[11])。正常組(腹腔注射等量氯化鈉溶液)、模型組(腹腔注射等量氯化鈉溶液)、利巴韋林組(10 mg·kg-1)、四季抗病毒合劑組(按生藥量計為3 232、1 616、808、404、202 mg·kg-1)、PC組(按連翹酯苷A計為5.66、2.83、1.42、0.71、0.35 mg·kg-1);造模2 h后開始腹腔注射給藥,連續(xù)給藥15 d,每日1次,每次0.1 mL;每日記錄存活動物數(shù)與體質(zhì)量,計算平均存活時間、存活率、臨床評分值(按文獻中的方法[12]評價)等參數(shù)。

2.6 肌肉勻漿液與血清中炎癥因子檢測

按照BD cytometric bead array mouse inflammation kit說明書,參考文獻[11]檢測EV71感染乳鼠肌肉勻漿液與血清中白細胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 EV71毒力測定

研究結(jié)果表明,EV71對Vero細胞的TCID50為10-5.68·mL-1。該病毒被RT-PCR擴增后得到了特有的226 bp條帶,表明該病毒為EV71。

3.2 SJM與PC對Vero細胞的毒性

各組的SJM與PC對Vero細胞的存活率及抑制率見表2,按Reed-Muench計算,SJM與PC對Vero細胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度分別為11.83 mg·mL-1(按生藥量計)、20.67 μg·mL-1(按連翹脂苷A計)。

表2 不同質(zhì)量濃度SJM與PC對Vero細胞的抑制作用 (n=10)

3.3 SJM與PC對ICR乳鼠的急性毒性

ICR乳鼠腹腔注射32.32 g·kg-1SJM或56.64 mg·kg-1PC 15 d后,單次組與連續(xù)組均未出現(xiàn)死亡,與相應(yīng)對照組相比,乳鼠精神狀態(tài)、飲食、活動等情況,無明顯異常,且合群、無炸毛、毛色有光澤,表明32.32 g·kg-1SJM與56.64 g·kg-1PC單次和連續(xù)腹腔注射對7日齡ICR乳鼠均無明顯致毒作用。

3.4 SJM與PC體外抗EV71活性

研究結(jié)果表明,SJM與PC均能劑量依賴性抑制EV71的增殖。SJM與PC在高質(zhì)量濃度時能顯著提高感染EV71的Vero細胞的存活率和保護率,各梯度質(zhì)量濃度的SJM與PC組均能不同程度地減少EV71對Vero細胞造成的病變與死亡。見表3。

表3 不同藥物對感染EV71后的Vero細胞的存活率與保護率的影響 (n=5)

3.5 SJM與PC體內(nèi)抗EV71活性

研究結(jié)果表明,EV71感染ICR乳鼠分別注射不同劑量的SJM或PC可顯著延長乳鼠的存活時間。四季抗病毒合劑組與PC組乳鼠的存活時間、存活率及臨床評分均優(yōu)于模型組,且呈劑量依賴性改善,甚至優(yōu)于利巴韋林組。見表4、表5。臨床評分值按文獻方法[12]評價,即正常為0分;行為異?；螂x群為1分;豎毛、易激、狂躁為2分;僅上肢麻痹僵硬,運動能力減弱,體質(zhì)量下降為3分;下肢或四肢完全癱瘓、共濟失調(diào),失去運動能力為4分;瀕死為5分。模型組乳鼠從第3天開始出現(xiàn)精神萎靡、稀便等病態(tài)反應(yīng),至第8天全部死亡。3 232、1 616、808 mg·kg-1四季抗病毒合劑組和5.66、2.83、1.42 mg·kg-1PC組及利巴韋林組治療初期(0～5 d)癥狀明顯改善,四季抗病毒合劑組比相當(dāng)量的PC組改善情況略好,后期病情惡化直至死亡。綜上所述,SJM與PC均能顯著改善手足口病模型乳鼠的臨床癥狀,均可顯著抑制EV71的增殖。

表4 SJM與PC對接種EV71的ICR乳鼠的存活狀況的影響

表5 SJM與PC抗接種EV71的ICR乳鼠的臨床評分 (n=12)

3.6 SJM與PC對炎癥分子的調(diào)節(jié)作用

感染EV71的手足口病模型乳鼠于6 d后取肌肉、血清,檢測肌肉勻漿液與血清中的炎癥因子水平,結(jié)果表明,SJM與PC可有效調(diào)節(jié)乳鼠IL-6、TNF-α、MCP-1的水平,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見圖1。SJM的調(diào)節(jié)效果略優(yōu)于PC。該結(jié)果表明,SJM與PC是通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)和炎癥因子水平抗EV71從而緩解和治療手足口病的。

注:A.IL-6;B.TNF-α;C. MCP-1;與對照組比較,**P<0.01,*P<0.05。

4 討論

SJM為國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的標準制劑[批準文號為WS-11454(ZD-1454)-2002-2012Z],具有清熱解毒、消炎退熱的功效,主治小兒呼吸系統(tǒng)疾病、病毒性感冒、手足口病等[3-4],其由連翹、桑葉、魚腥草、菊花、薄荷、荊芥、桔梗、紫蘇葉、苦杏仁、蘆根和甘草11味中藥組成。

君藥之一連翹,透邪清熱、芳香辟穢、解毒;君藥之二魚腥草,清解肺熱、化痰排膿;君藥之三桑葉,疏散上焦風(fēng)熱、清宣肺熱、涼潤肺燥。3味君藥相須為用,疏散風(fēng)熱、清熱解毒、宣肺止咳。臣藥之一桔梗,宣肺、利咽、祛痰、排膿;臣藥之二菊花,散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒;臣藥之三苦杏仁,降氣止咳平喘、潤腸通便。3味臣藥和合,清泄肺熱解毒、宣降肺氣復(fù)清肅,可增強君藥清熱宣肺之力。佐藥之一薄荷,佐君臣疏散風(fēng)熱、清利頭目、利咽、透疹、通鼻竅;佐藥之二荊芥,解表散風(fēng)、透疹、消瘡;佐藥之三紫蘇葉,解表散寒、行氣和胃,與荊芥佐連翹發(fā)汗逐外邪;蘆根,清熱瀉火、生津止渴,與佐藥同用以消散主兼癥;桔梗,宣肺利咽、祛痰排膿;甘草,補脾益氣、清熱解毒、去痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥,與桔梗合用,兼具佐使之功。全方合用,疏風(fēng)透表、清熱解毒、宣肺止咳。

本研究建立的EV71感染細胞和ICR乳鼠模型,可用于研究SJM與PC治療手足口病的藥效與機制。研究表明SJM與PC具有顯著體內(nèi)、外抗EV71的作用,4 850、2 430、1 220 μg·mL-1SJM與8.50、4.25、2.13 μg·mL-1PC可顯著提高感染細胞的平均存活率(P<0.05或P<0.01)和平均保護率;二者亦可呈劑量依賴性提高感染乳鼠的存活率并延長存活時間(P<0.05或P<0.01),3 232 mg·kg-1SJM與5.66 mg·kg-1PC組感染乳鼠的存活時間長于利巴韋林組(P<0.05或P<0.01)。前期的研究結(jié)果表明SJM治療手足口病具有顯著療效[4-5],本研究將PC組與四季抗病毒合劑組聯(lián)合研究,佐證了PC在SJM治療手足口病中的重要貢獻。PC中的連翹酯苷A、連翹酯苷B、連翹苷是君藥連翹的主要藥效成分[13-14];綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡?？鼘幩崾蔷幘栈ǖ闹饕幮С煞諿15];綠原酸可有效抑制大部分病毒[16];二咖啡?？鼘幩峥捎行Э寡住⒖共《?、調(diào)血脂[17];甘草具有抗病毒、抗菌、消炎、解毒、減毒的作用[18-19],甘草苷、甘草酸是其主要藥效成分[20]。這些重要成分使得PC具有較好的抗EV71的效果。機制研究結(jié)果表明,SJM與PC均具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用,可有效調(diào)節(jié)重要炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1在肌肉與血清中的水平,這可能是SJM與PC抗EV71型手足口病的潛在作用機制。同時也證明了PC是SJM中不可或缺的化合物,是SJM抗手足口病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。但是PC不等同于SJM,PC僅是活性成分的組合,SJM則是11味中藥組成的復(fù)方制劑,其按照君臣佐使原則相配伍,多成分多靶點相互關(guān)聯(lián),以整體發(fā)揮藥效,這可能是SJM抗手足口病的效果略優(yōu)于PC的重要原因。