劉 影，張 睿，楊 雪，鄧加加，徐 鋒，2

(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)薏苡仁資源與開發(fā)研究中心，貴州 貴陽 550000)

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coixlacrma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟種仁，現(xiàn)代研究表明，薏苡仁除了能夠降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)腸胃和機(jī)體免疫功能外，其主要的化學(xué)成分更是包含有抗腫瘤、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化等活性成分[1-6]，在臨床上對多種惡性腫瘤、婦科疾病、各種炎癥、免疫力低下等具有明顯的治療作用[7]。因此，對于薏苡仁藥材化學(xué)成分的研究也在不斷的深入當(dāng)中。關(guān)于薏苡仁酯類成分的抗腫瘤作用研究，最早出現(xiàn)在1961年，英國學(xué)者從薏苡仁中第一次分離出薏苡仁酯并推測其為薏苡仁抗腫瘤的主要化學(xué)成分[8]，后面陸續(xù)從薏苡仁中分離出的無羈萜、白茅素、圣草素等也使得薏苡仁藥材發(fā)展更進(jìn)一步[9-10]。

對于薏苡仁質(zhì)量控制方面的技術(shù)大都采用分光光度法、紅外光譜法、色譜法、生物效價法等[11-14]。關(guān)于中藥材或中藥制劑的優(yōu)劣評價、真?zhèn)舞b別、物種區(qū)分方面的相關(guān)技術(shù)，普遍采取中藥指紋圖譜，該法是一種綜合的、可量化的鑒定手段，能夠較大程度的保證中藥材、中藥制劑等在質(zhì)量控制研究當(dāng)中的優(yōu)良性、真實(shí)性、穩(wěn)定性、一致性等。目前針對薏苡仁的相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)注點(diǎn)都主要集中在脂溶性成分，而少有對薏苡仁藥材整體質(zhì)量的一個控制、評價和比較。本研究將針對黔產(chǎn)野生和家種薏苡仁藥材建立HPLC指紋圖譜，意在通過指紋圖譜分析比較兩者之間的一個差異，用于二者之間的鑒別，以期為二者臨床用藥提供參考。

1 材 料

1.1 儀 器

高速粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；JP2-160電子天平，日本；藥匙；稱量紙；具塞錐形瓶；玻璃漏斗；濾紙，杭州富陽北木漿紙有限公司；蒸發(fā)；DHS0260超聲波清洗機(jī)，天津奧泰；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州越新儀器制造有限公司；玻璃棒；2 mL容量瓶；一次性注射器；0.22 μm有機(jī)相濾；高液小瓶；Waters高效液相色譜儀(E2695)。

1.2 試劑與藥材

分析冰醋酸，重慶川東化工有限公司；色譜甲醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；色譜乙腈，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；哇哈哈純凈水；薏苡素對照品(批號：J26GB152842)、甘油三油酸酯對照品(MUST-2008 2001)，上海源葉生物科技有限公司；10批市面收集的產(chǎn)地貴州的薏苡仁；10批采自貴州的野生薏苡仁。具體來源見表1和表2。

表2 黔產(chǎn)家種薏苡仁藥材來源

1.3 薏苡仁藥材的產(chǎn)地來源

實(shí)驗(yàn)所用的野生和家種薏苡仁均來自于貴州省的幾個不同產(chǎn)地，經(jīng)鑒定詳細(xì)情況見表1，表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters Diamonsil Plus 5 μm C18(250 mm×4.6 mm)色譜柱，乙腈(A)-0.05%乙酸水 洗脫系統(tǒng)梯度洗脫(0～40 min，5%～30%A；40～55 min，30%～40%A；55～65 min，40%～70%A；65～85 min，70%～100%A；85～87 min，100%～5%A)，流速0.1 mL·min-1，柱溫設(shè)置為30 ℃，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定薏苡仁樣品粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇，超聲提取0.5 h，濾過于蒸發(fā)皿中，置65 ℃水浴鍋上揮干，揮干剩下物質(zhì)加甲醇溶解并定容至2 mL，用有機(jī)相微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液1.5～2 mL于高液小瓶中，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取薏苡仁供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下給出的色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以13號峰為參照峰，測得共有峰與參比峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取薏苡仁藥材6份，按“2.2”項(xiàng)下的操作制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測得其各共有峰與參比峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下方法分別在0、4、8、16、32、64 h進(jìn)樣，測定薏苡仁供試品溶液，其各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在室溫下64 h內(nèi)穩(wěn)定，足以滿足穩(wěn)定性要求

2.4 指紋圖譜的建立

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定10批黔產(chǎn)家種薏苡仁樣品與10批黔產(chǎn)野生薏苡仁樣品，根據(jù)檢測結(jié)果建立薏苡仁的UPLC指紋圖譜，見圖1、圖2、圖3和圖4。家種薏苡仁選擇了以保留時間約32.851的峰為參照峰S，共確立了26個共有峰；野生薏苡仁選擇了以保留時間約24.637的峰為參照S，確立了23個共有峰。并對各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積進(jìn)行了計算，見表3和表4。

圖1 10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的HPLC對照指紋圖譜

圖2 10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的HPLC對照指紋圖譜

圖3 10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的HPLC對照指紋圖譜

圖4 10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的HPLC指紋圖譜

表3 10批野生薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對保留時間

表4 10批野生薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對面積

2.5 相似度評價

將收集的10批黔產(chǎn)家種薏苡仁和10批黔產(chǎn)野生薏苡仁藥材的圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012年版相似度軟件，進(jìn)行相似度的評價，具體相似度見表5和表6。

表5 10批家種薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對保留時間

表6 10批家種薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對面積

在對收集到的10批黔產(chǎn)家種和10批黔產(chǎn)野生薏苡仁藥材的HPLC指紋圖譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的相似度在0.852～0.994，10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的相似度為0.808～0.983。從二者的指紋圖譜中可以明顯的看出二者指紋圖譜的不一樣，其中就包括二者共有峰的個數(shù)和分布情況。

3 討 論

3.1 提取方式的考察

在對薏苡仁的處理上，分別采用了乙腈-二氯甲烷(65∶35)、石油醚、乙酸乙酯和甲醇作為溶劑，利用超聲和回流的提取方式，結(jié)果表明，在用甲醇作為提取溶劑，超聲30 min的條件下，對藥材中各成分的提取效果較好，且色譜峰的數(shù)量也較多。

3.2 色譜條件的考察

本研究依次對甲醇-水、乙腈-0.05%乙酸水和甲醇-0.05%乙酸水等流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.05%乙酸水的條件下其每個峰的分離度較好。考察不同的流速(0.8、1.0 mL·min-1)和柱溫(25、30 ℃)對色譜峰分離度的影響，發(fā)現(xiàn)流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃的色譜峰分離度良好。

3.3 檢測波長的選擇

按“2.1”色譜條件對黔產(chǎn)家種和野生薏苡仁進(jìn)行了多波長掃描檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在254 nm波長處，各峰的分離度良好，基線較平穩(wěn)，吸收較大且所出的峰個數(shù)較多，特此選擇254 nm作為檢測波長。

3.4 黔產(chǎn)家種和野生薏苡仁的差異

本研究分別建立了10批黔產(chǎn)家種和10批黔產(chǎn)野生薏苡仁藥材的HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的相似度在0.852～0.994，10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的相似度為0.808～0.983，二者各自的相似度均較高。對黔產(chǎn)野生薏苡仁和家種薏苡仁指紋圖譜進(jìn)行比較，可以明顯發(fā)現(xiàn)兩者的色譜峰個數(shù)和共有峰峰面積均存在較大差異，家種的共有峰為26個，野生的則只有23個，在整體共有峰的分布上來說，家種薏苡仁的共有峰以保留時間60 min為界，在保留時間60 min后仍發(fā)現(xiàn)約11個共有峰出現(xiàn)，且分布較密集，峰面積亦較大，野生薏苡仁在約60 min所出現(xiàn)的峰則只有4個，且分布較均勻，峰面積較前者亦更小。我們推測黔產(chǎn)野生薏苡仁相較于黔產(chǎn)家種薏苡仁來說，其藥材內(nèi)共有成分較少，可能與其生長環(huán)境有較大的聯(lián)系。由上可知HPLC液相指紋圖譜可用于黔產(chǎn)野生和家種薏苡仁的識別，可為兩者的深入研究提供一定的參考。