張曉曦，楊海飛

(1 徐州市檢驗檢測中心，江蘇 徐州 221000；2 徐州醫(yī)科大學藥學院，江蘇 徐州 221004)

隨著納米技術的飛速發(fā)展，越來越多的納米材料被篩選出用于生物醫(yī)藥領域的不同研究中。其中，納米載藥微球因具有高比表面積，高表面反應活性，緩釋控釋藥物等優(yōu)點，在疾病治療中突顯出了極大的應用潛力。然而，微球的載藥性能應用于臨床實驗中，效果并不理想。對微球進行改性，提高其作為藥物載體的功能，十分有必要。納米瓶是指具有中空體和單個表面開口的膠體顆粒。近年來，由于其快速裝載化學試劑、治療診斷試劑和納米材料的能力，納米瓶成為多種類型物質的包載和可控釋放的理想載體[1]。另一方面，納米瓶具有良好的開口特性，允許多種類型的物質，無論尺寸大小，都可以輕松包載和釋放。納米瓶制備過程中的關鍵技術是如何確保在空心粒子的壁中僅產生單個開口。有文獻報道通過提取高分子基質中包封的溶劑，制備聚氨酯，聚己內酯或聚甲基硅氧烷納米瓶[2]。然而，這種方法只適用于某些類型高分子，并且產物往往具有較為廣泛的尺寸分布。另一種制備納米瓶的方法是在整個模板表面選擇性地沉積一層固體材料，如二氧化硅(SiO2)等[3]。然而，為了實現(xiàn)這種選擇性沉積，模板必須采取非對稱的Janus結構或位于界面處，因而不適用于大規(guī)模生產。聚多巴胺(Polydopamine，PDA)是一種新型多功能聚合物，由多巴胺單體自發(fā)氧化聚合而得[4]。PDA在近紅外區(qū)有強吸收，具有很高的光熱轉換效率[5]，且生物相容性優(yōu)良，黏附性和化學反應性高，表面基團多，易于修飾，這些特性使得PDA納米材料在可控釋放、腫瘤治療等領域得到了快速發(fā)展[6-7]。

基于上述研究背景，本工作提出基于商用聚苯乙烯微球(PS)，利用溶脹誘導的壓力制備聚多巴胺包裹的聚苯乙烯開口納米瓶[8]。在將PS表面涂覆薄膜一層PDA后，我們引入甲苯/水乳液以膨脹PS核心。當吸收甲苯后，膨脹的PS核會對PDA殼產生一定的壓力。當壓力超過一定閾值時，PDA殼上會產生一個孔，使膨脹的PS通過開口逃逸。隨著PS的擠出，對PDA殼的壓力將被釋放，從而確保在PDA表面只產生一個單孔。接著我們用乙醇淬滅膨脹過程，并用四氫呋喃(THF)溶解PS核，從而得到表面僅有一個單開口的PDA中空納米瓶。我們進一步考察了其包載和可控釋放小分子物質的能力。選擇明膠作為熱敏材料，利用其可逆的凝膠-溶膠轉變行為，并將其與實驗室自行合成的ATP響應小分子探針(AY)與PDA納米瓶共孵育，利用PDA的光熱效應，通過改變溫度的方式，實現(xiàn)AY在PDA納米瓶空腔中的包載與溫控釋放。

1 實 驗

1.1 儀器試劑

ZD-85氣浴恒溫振蕩器，天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠；旋渦混勻儀，陜西瑞譜威生物科技有限公司；超聲波清洗器，江蘇昆山超聲儀器公司；熒光分光光度計，安捷倫科技有限公司；H1650臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；IX73倒置熒光顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

聚苯乙烯微球，三(羥甲基)氨基甲烷，鹽酸多巴胺，甲苯，四氫呋喃，無水乙醇，羅丹明6G，A型明膠，十二烷基硫酸鈉。實驗用水為去離子水。

1.2 PS@PDA核殼納米顆粒的合成

離心收集0.5 mL聚苯乙烯微球的水懸浮液(2.5%，W/V)，用蒸餾水洗滌三次，并分散在10 mL含有1 mg/mL多巴胺鹽酸鹽的Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L，pH=8.5)中。在室溫下反應12 h后，離心收集固體產物，即為PS為核、PDA為殼的PS@PDA納米顆粒。為了增加PDA殼的厚度，我們將獲得的PS@PDA納米顆粒重新分散在10 mL含有1 mg/mL多巴胺鹽酸鹽的Tris-HCl緩沖液中以進行另一輪涂覆。在完成二輪和三輪涂覆后，PDA殼的厚度分別增加到30 nm或50 nm。本實驗最終選用厚度為50 nm的PDA殼。將所得PS@PDA核-殼納米顆粒分散在1 mL蒸餾水中，用于后續(xù)實驗。

1.3 開口PDA納米瓶的制備

在通風櫥中，將0.1 mL甲苯與9.9 mL蒸餾水(內含1%(W/V)十二烷基硫酸鈉)混合后超聲乳化，制得1%(V/V)甲苯/水乳狀液。然后將0.5 mL PS@PDA核殼納米顆粒加入至10 mL甲苯/水乳狀液中，置于搖床中，室溫下孵育6 h(200～300 rpm)，使PS發(fā)生溶脹。之后加入20 mL乙醇，終止溶脹過程。離心5 min(6000 rpm)收集固體產物，并用乙醇多次洗滌。最后，加入10 mL四氫呋喃，搖床中(200～300 rpm)孵育4 h，以溶解所有的PS核。用四氫呋喃洗滌兩次，得到表面有單開口的中空PDA納米瓶。

1.4 ATP響應熒光小分子(AY)的合成

將二乙基三胺(20 mL，184 mmol)和羅丹明B(4 g，8.4 mmol)的50 mL無水乙醇溶液加入到250 mL圓底燒瓶中，在90 ℃下攪拌3 h，直至溶液顏色變?yōu)槌壬?。利用旋轉蒸發(fā)儀除去未反應的溶劑，之后用飽和碳酸氫鈉溶液和二氯甲烷對含油混合物進行多次萃取，使有機層濃縮。在硅膠上用柱層析純化殘渣(二氯甲烷∶甲醇=10∶1)，得到淡黃色固體即為所需的ATP響應熒光小分子，命名為AY。AY的結構如圖3所示。

1.5 有機小分子AY在中空PDA納米瓶中的包載

將100 mg明膠分散于0.5 mL PBS溶液中，在50 ℃下孵育20 min，得到質量分數(shù)為20%的明膠溶液。然后依次加入1 mg AY小分子，1 mg PDA納米瓶，在37 ℃下振蕩孵育30 min(300 rpm)。通過離心(12000 rpm，10 min)收集固體產物。用37 ℃蒸餾水洗滌兩次后，繼續(xù)在冰浴中孵育30 min，誘導明膠溶液在PDA表面的凝膠化。在此過程中，AY會被包載到納米瓶的空腔中。將包載有小分子的明膠/PDA納米瓶在0 ℃冷水中超聲分散10 s，然后離心和冷水洗滌兩次，保存在4 ℃中，以備后續(xù)使用。

1.6 AY小分子從中空PDA納米瓶中的釋放

取適量包載有小分子的明膠/PDA納米瓶分散在1 mL蒸餾水中，分別在室溫和37 ℃下孵育10 min。然后離心3 min，收集上清液，利用熒光分光光度計測定上清液中釋放出來的AY小分子的熒光光譜，并進行兩個溫度下熒光強度的比較。激發(fā)波長為480 nm。平行測定3次。

2 結果與討論

2.1 開口PDA中空納米瓶的形貌表征

本工作中，開口PDA中空納米瓶是首先通過在聚苯乙烯微球PS上涂覆一層多巴胺鹽酸鹽(PDA)，然后分別用1%甲苯/水乳液溶脹6 h，使PS核膨脹。甲苯/水乳液體系可以保證PS核僅發(fā)生緩慢膨脹，而不會溶解。在此膨脹過程中，PDA外殼會出現(xiàn)開口，使膨脹的PS逸出。利用四氫呋喃溶解PS核，從而獲得在表面具有單開口的中空PDA納米瓶。我們對此過程中PDA納米瓶的形貌進行了表征。圖1A和圖1B分別為開口PDA中空納米瓶的掃描電鏡和透射電鏡圖。從圖1A中可以觀察到，在PDA表面出現(xiàn)了開口形貌，且PDA納米顆粒尺寸較為均勻。該結果也與文獻報道的PDA納米瓶形貌特征相符。同時，圖1B中的透射電鏡結果也進一步證實，在每個約500 nm大小的PS微球表面上形成約50 nm厚度的均一PDA殼。

圖1 開口PDA中空納米瓶的掃描電鏡(A)和透射電鏡圖(B)

圖2為PS核膨脹初期，納米瓶的透射電鏡圖。與圖1相比，納米瓶未出現(xiàn)開口特征，證實了在甲苯/水乳液體系中，PS核的膨脹進行地非常緩慢。

圖2 PS核膨脹初期，納米瓶的透射電鏡圖

2.2 AY小分子在開口PDA中空納米瓶中的包載

我們接下來嘗試將前期合成的ATP響應小分子熒光探針包載到開口PDA中空納米瓶中。AY有機小分子的結構如圖3A所示。利用透射電鏡表征了PDA納米瓶包載AY后的形貌變化。如圖3B所示，AY包載后，納米瓶由中空結構變成實心結構，空腔被填滿，且尺寸明顯增大。這主要是由于AY與明膠以固態(tài)的形式，共同保留在納米瓶的空腔中。為了進一步直觀地證實AY探針在PDA納米瓶中的負載，我們對負載后的產物進行了倒置熒光顯微鏡的表征。圖3C中，出現(xiàn)了AY探針的特有紅色熒光，說明AY探針已經成功包載在PDA納米瓶中。

圖3 AY有機小分子的結構式(A)；開口PDA納米瓶包載AY后的透射電鏡圖(B)；開口PDA納米瓶包載AY后的倒置熒光顯微圖(C)

2.3 AY小分子從PDA納米瓶中的釋放

接下來，我們考察了AY探針從PDA納米瓶中的釋放行為。由于PDA具有良好的光熱效應，當對其加熱時，空腔中的明膠將經歷從固體到液體的相變，從而觸發(fā)包載物的釋放。我們通過檢測室溫和37 ℃下，上清液中釋放出來的AY小分子的熒光強度，比較了溫度對納米瓶釋放性能的影響。如圖4A所示，在480 nm的激發(fā)波長下，AY小分子在550 nm處出現(xiàn)了一個明顯的發(fā)射峰(2號曲線)。而在室溫條件下得到的上清液中，檢測到的AY的熒光強度很弱(3號曲線)，遠低于在37 ℃加熱后上清液中AY的熒光強度(1號曲線)。為了更加直觀地比較，我們擬合了室溫和37 ℃下，釋放出來的AY的最大熒光強度(圖4B)。結果進一步表明，室溫下，PDA納米瓶幾乎不釋放AY，大部分AY仍以固態(tài)的形式保留在納米瓶中。隨著溫度上升至37 ℃，AY小分子釋放的程度也顯著上升。

圖4 室溫和37 ℃下，上清液中釋放出來的AY小分子以及AY小分子本身的熒光光譜圖(A)以及兩個溫度下熒光強度(550 nm)的柱狀圖比較(B)，平行測定3次

我們進一步考察了37 ℃下，在不同時間內，AY從PDA納米瓶中的釋放行為。如圖5所示，隨著釋放時間的延長，550 nm處的熒光強度逐漸增強，證實了AY小分子從PDA納米瓶中的持續(xù)釋放。

圖5 37 ℃下，在不同時間，AY從PDA納米瓶中的釋放的熒光光譜圖

3 結 論

本工作基于聚苯乙烯微球和聚多巴胺，利用溶脹誘導的壓力，制備了一種具有單開口的PS@PDA中空納米瓶。進一步將明膠與小分子探針混合，借助明膠在不同溫度下的可逆凝膠-溶膠轉變，實現(xiàn)小分子探針在納米瓶中的可控包載與釋放。該納米材料制備工藝簡單，穩(wěn)定性良好，有望在藥物傳遞和催化等方面得到進一步發(fā)展與應用。