林志鑾，張傳海

(福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點實驗室(武夷學(xué)院)，福建 武夷山 354300)

百合科黃精屬(Polygonatum)的多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)是多年生藥用植物，以塊狀根莖入藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，多花黃精具有防動脈硬化、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、降血脂、抗菌、抗病毒、提高機體免疫力等多種藥理作用[1]。其多糖、多酚、總黃酮是多花黃精塊狀根莖的主要有效成分也是衡量多花黃精藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[2]。

在多花黃精成分研究上，以考察多糖[3]、總黃酮[4]、總皂甙[5]的成分居多，對多花黃精的多酚檢測及其生物活性評價報道比較少。

以閩北多花黃精為研究對象，優(yōu)化多花黃精多酚提取工藝條件，并對多花黃精多酚的羥基自由基清除能力和與牛血清白蛋白的相互作用進行了評價，以期為推動閩北多花黃精的資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實 驗

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 原料

實驗材料采自福建省南平市南武夷藥博園，經(jīng)武夷學(xué)院張傳海教授鑒定：是百合科黃精屬的多年生草本植物，多花黃精(學(xué)名：PolygonatumcyrtonemaHua)。將塊狀根莖，洗凈，烘干，用高速藥物粉碎機進行粉碎，過60目篩，備用。

1.1.2 試劑

十二水合硫酸亞鐵、焦沒食子酸、濃硫酸、鎢酸鈉、無水鉬酸鈉、濃磷酸、吖啶紅、羅丹明B、十二烷基苯磺酸鈉、無水乙醇、牛血清蛋白(BSA)、氯化鈉以上試劑為分析純AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，水為去離子水(自制)。

1.1.3 主要試劑配置

酒石酸亞鐵溶液：準(zhǔn)確稱取1.0000 g的硫酸亞鐵，5.0000 g的酒石酸鉀鈉，用水溶解并定溶到1 L。

磷酸緩沖液(pH=7.5)：準(zhǔn)確稱取23.90 g磷酸氫二鈉·10H2O，加去離子水定溶到1 L；準(zhǔn)確稱取9.08 g的磷酸二氫鉀(110 ℃下烘2 h)，加去離子水定溶到1 L；分別取85 mL的磷酸氫二鈉溶液和15 mL的磷酸二氫鉀混合均勻。

1.2 主要儀器

F4500熒光分光光度計，日本日立公司；KH5200DE微波爐，上海生物科技有限公司；BSA323S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；WK-400A高速藥物粉碎機，青州市精誠醫(yī)藥制造有限公司。

1.3 顯色反應(yīng)

參考鄧祥[6]、袁佩穎[7]的方法，準(zhǔn)確吸取試液2.00 mL于10 mL容量瓶中，加入2.00 mL酒石酸亞鐵溶液，在30 ℃恒溫下30 min后，用pH=7.5磷酸緩沖液定溶，顯色。

1.4 熒光測試掃描工作條件

利用熒光分光光度計的3D掃描模式，光電壓為700 V，Ex和Em的λ起始=200 nm，λ終止=750 nm，Ex和Em的狹縫均為5 nm，掃描速度為12000 nm/min。獲得最佳的激發(fā)波長和檢測波長。

1.5 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

準(zhǔn)確移取0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL焦沒食子酸(2.00 mg/mL)按1.3步驟進行顯色，在最佳的激發(fā)和發(fā)射波長下，測定各沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對熒光強度(A)。

1.6 單因素實驗

以多花黃精提取液的得率為指標(biāo)，分別對料液比(1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL、1∶40 g/mL、1∶50 g/mL)的乙醇溶液，微波功率(540 W、630 W、720 W、810 W、900 W)，微波時間(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)，乙醇溶液濃度(60%、70%、80%、90%、100%)等有關(guān)因素進行考察和分析，確定合適的水平。

1.7 多花黃精多酚含量測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g多花黃精粉末，按照優(yōu)化提取工藝條件，進行微波輔助提取。提取液經(jīng)過抽濾和減壓濃縮后，定容到25 mL。準(zhǔn)確移取2.00 mL提取液，按照1.3方法進行顯色，測定各樣品相對熒光強度A。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式，計算不同提取多酚的含量(mg/g)。

多酚含量=(C×N×V)/M

式中：C為提取液多酚濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為最初定容體積，mL；M為多花黃精粉末樣品的質(zhì)量，g。

1.8 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以料液比、乙醇濃度、微波功率、微波提取時間為4個變量，通過單因素試驗，利用 Box-Behnken軟件設(shè)計L9(34)四因素三水平試驗，如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素水平及編碼

1.9 羥基自由基的清除率測定

按照張傳海[8]的實驗步驟進行測定。在該體系中，未添加Fento和多酚試劑的熒光值記為A1；未添加多酚試劑的熒光值記為A2；添加多酚試劑2.00 mL的，記為A3。按下面公式計算多酚對·OH的清除率：

清除率=[(A3-A2)/(A1-A2)]×100%

1.10 BSA的相互作用

準(zhǔn)確移取1.00 mL BSA(1×10-5mol/L)溶液，2.00 mL pH=7.4 Tris-HCL緩沖液(含0.15 mol/L NaCl)，加入不同體積的多酚試劑，用去離子水定容至10.00 mL，水浴恒溫25 ℃靜置5 min，按照1.4試驗步驟。確定多酚提取液對BSA的相互作用的最佳λEx與λEm。

2 結(jié)果與討論

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)1.5中的方法來測定焦沒食子酸與空白參比的相對吸光度，得到?jīng)]食子酸濃度與相對吸光度(A)函數(shù)的線性回歸方程：Y=-23.006X+ 2542.2，R=0.9998。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 微波功率、乙醇濃度、提取時間和料液比對多花黃精多酚得率的影響

在討論不同的微波功率、乙醇濃度、微波時間和料液比對多花黃精多酚的得率的影響。由圖2(A)可知，在微波處理功率為810 W時，多酚得率達到最高值10.03 mg/g，而后隨著微波功率繼續(xù)增加，提取率下降。由于微波功率在一定范圍內(nèi)，植物細胞內(nèi)部發(fā)生膨脹，細胞壁破碎，多酚類物質(zhì)流出；微波功率過高，致使部分多酚分解，使多酚提取量降低[9-10]。因此，選擇提取功率為810 W為優(yōu)。由圖2(B)可知。當(dāng)乙醇濃度為80%時，提取率達到最高值9.57 mg/g，隨著乙醇濃度的增加提取率反而下降。因此，選擇乙醇濃度為80%為宜。由如圖2(C)可知。當(dāng)微波時間為8 min時，提取率達到最高值8.73%，隨著微波時間的增加提取率反而下降。因此，選擇微波時間為8 min為佳。 由如圖2(D)所示。當(dāng)料液比為1∶30 g/mL時，提取率達到最高值8.86%，隨著料液比增加多酚得率緩慢增加隨著液料比的進一步增大，由于多酚已經(jīng)基本全部溶出，隨著溶劑的增多，反而會將雜質(zhì)溶出[11-12]。因此，選擇最佳的料液比為1∶30 g/mL為宜。

圖2 微波功率、微波時間、乙醇濃度、料液比對多酚得率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對長根菇多酚提取工藝條件進行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸模型的方差分析數(shù)據(jù)見表3。

表2 L9(34)響應(yīng)試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸方程各項方差分析

在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計L9(34)正交實驗，進一步考察乙醇濃度、微波時間、料液比、微波功率對多酚得率的影響，以確定最佳的提取多酚的工藝條件。響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示。

回歸模型的建立及顯著性分析 使用Design-Expert 12軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合。A(提取功率)、B(提取時間)、C(乙醇濃度)、D(料液比)和 Y(多花黃精多酚得率)之間的二次多項回歸方程為：Y=10.03+0.1297A-0.1853B-0.1761C+0.1575D+0.0556AB+0.1807AC+0.0139AD-0.1390BC-0.1251BD+0.0695CD-0.3192A2-0.2845B2-0.1038C2-0.4304D2

模型F值=3.88意味著該模型具有重要意義，模型中P=0.0081<0.0500表示模型項是顯著的。如表3所示，各因素對多酚得率的影響順序依次為提取時間，乙醇濃度和料液比。失擬誤差項P=0.0081<0.05，失擬誤差不顯著，表明模型選擇合適，可以使用此模型對多花黃精多酚得率工藝進行分析和預(yù)測。

2.3.2 響應(yīng)面試驗的交互因素分析

分別將模型中的一個因素固定在中間水平，得到另外一個因素交互作用對多酚得率影響的子模型，并根據(jù)模型繪制三維曲面圖，見圖3。

圖3 微波功率、微波時間、乙醇濃度、料液比交互作用對多花黃精多酚得率的影響

圖4 空白試樣(E)、焦沒食子酸(F)和多酚提取液(G)的3D掃描

2.4 熒光法測定多花黃精多酚對·OH的清除率

2.4.1 最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長確定

對空白試樣(E)、焦沒食子酸(F)和多酚提取液(G)進行3D掃描，根據(jù)3D掃描結(jié)果，確定本實驗的檢測條件為：λex=450 nm，λem=440 nm。

2.4.2 多花黃精多酚對羥自由基的清除率在測試體系中分別加入 0.50、1.00、1.50、2.00 mL的焦沒食子酸溶液(2.00 mg/mL)、多花黃精多酚提取液、VC溶液(2.00 mg/mL)進行體外羥基自由基清除能力檢測，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著樣品加入量的增多，對于羥基自由基的清除率也在增大，當(dāng)多酚加入2.00 mL后，多酚清除率達到13.80%。

圖5 多花黃精多酚提取液與焦沒食子酸、Vc對羥基自由基清除能力的比較

圖6 牛血清白蛋白結(jié)合實驗中對空白試樣(H)、焦沒食子酸(I)和多酚提取液(J)的3D 掃描

2.5 熒光法測多花黃精總多酚與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用

2.5.1 最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長確定

對空白試樣(H)、焦沒食子酸(I)和多酚提取液(J)進行3D掃描，根據(jù)3D掃描結(jié)果，確定本實驗的檢測條件為：λex=450 nm，λem=250 nm。

2.5.2 多酚提取液與BSA的相互作用

在測試體系中加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的焦沒食子酸溶液(2.00 mg/mL)、多酚提取液進行體外牛血清白蛋白結(jié)合實驗，實驗結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著多花黃精多酚提取液的加入量增多，對于牛血清白蛋白結(jié)合作用也在增大，當(dāng)加入量達到2.50 mL后，與牛血清結(jié)合律為12.50%。推測這些酚類化合物被氧化后從而形成復(fù)合物，進而影響蛋白質(zhì)功能性質(zhì)[13-14]。

圖7 多酚提取液與焦沒食子酸對牛血清白蛋白結(jié)合實驗的比較

3 結(jié) 論

本試驗利用微波輔助法提取多花黃精多酚，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗條件，優(yōu)化獲取最優(yōu)工藝為：微波時間為8 min，微波功率為810 W，料液比為1∶30 g/mL，乙醇濃度為80%，在此參數(shù)下多花黃精多酚得率11.06 mg/g。并通過對羥基自由基清除能力、牛血清結(jié)合能力試驗證明了多花黃精多酚具有一定的抗氧化活性和結(jié)合牛血清蛋白能力。