李 慧，龐姍姍，田家瑤，王云云，薛志飛，龔國利

(1 陜西科技大學設計與藝術學院，陜西 西安 710021；2 陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021)

GO雖然對溶菌酶具有良好的吸附作用，但GO與蛋白質(zhì)的相互作用，會擾亂蛋白質(zhì)結構的完整性，從而導致活性的降低[17-18]。Yang等[19]研究了溶菌酶在GO和RGO上的吸附，測定了載體對酶活性的抑制作用，與RGO相比，GO對溶菌酶活性表現(xiàn)出更強的抑制作用，GO誘導酶去折疊，導致α-螺旋結構喪失，色氨酸殘基暴露于水環(huán)境中，GO濃度從2 μg/mL增加到18 μg/mL，溶菌酶的活性從93.8%降低至56.2%，RGO濃度從0 μg/mL增加到2 μg/mL，溶菌酶活性增加2.4%，當RGO濃度增加到18 μg/mL，仍保留初始酶活94.9%。Chakrabarti等[16]研究了雞蛋清溶菌酶(HEWL)吸附在GO上對結構和功能的影響。結果顯示，雞蛋溶菌酶可以在GO上自發(fā)固定，固定后溶菌酶的二級和三級結構變化較小，但熱穩(wěn)定性和酶的活性顯著降低。GO對溶菌酶活性和構象具有顯著影響，GO固定溶菌酶，色氨酸殘基(Trp)的環(huán)境變化影響酶的活性位點，對酶活性產(chǎn)生抑制作用。

本文綜述近年來通過功能化修飾、包覆-吸附法、與天然高分子共混、位點特異性固定等方法，穩(wěn)定GO對溶菌酶的吸附量，減少抑制酶活的原理、方法，并對未來該領域的發(fā)展方向做出展望。

1 GO固定化溶菌酶的途徑

傳統(tǒng)的固定化酶的方式有共價結合、物理吸附、交聯(lián)、包埋四種。GO表面有豐富的含氧官能團，在固定溶菌酶時，主要有物理吸附法和共價結合法兩種途徑。

1.1 物理吸附法

GO作為載體，目前采用物理吸附法固定溶菌酶的應用較為廣泛。物理吸附法是通過載體表面和酶分子表面之間的范德華力、離子鍵、氫鍵、疏水相互作用等分子間弱相互作用力達到酶固定目的的方法。這種酶固定方式實驗條件便利，眾多研究學者在固定溶菌酶時采用了物理吸附法。比如：Zhang等[20]通過靜電吸附作用把溶菌酶固定在GO表面，然后將溶菌酶-GO共混到聚醚砜鑄膜液中，通過相轉(zhuǎn)化法制備了對大腸桿菌抑菌率可達68%的聚醚砜超濾膜。

1.2 共價結合法

共價結合法是通過共價鍵將酶表面的氨基酸殘基與載體表面的活性基團連接，進行酶固定的方法。與物理吸附法相比，共價固定的酶穩(wěn)定性更強，不易從載體表面脫離。這一方法要求載體上有較多的化學基團或者有較強的可修飾性，便于與酶分子結合。GO表面富含羥基，可以通過在載體表面引入氨基，再通過交聯(lián)劑固定化酶。文獻報道，溶菌酶可以通過共價結合法固定在殼聚糖表面[21-22]，殼聚糖分子中的游離氨基可通過雙功能試劑戊二醛與溶菌酶發(fā)生偶聯(lián)，固定后酶的最適pH降低0.5，最適溫度升高5 ℃，熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性的到提高。

2 固定化方法對溶菌酶吸附量及酶活性的影響

2.1 修飾-固定法對溶菌酶吸附量及酶活性的影響

納米材料的化學功能化是一種成熟的技術，用于將所需的官能團接枝到其表面上，獲得功能化改性納米材料的方法。GO表面具有環(huán)氧基、羥基、羧基等多種含氧基團，利用這些活性含氧基團與其它試劑發(fā)生化學反應，如GO的氨基化[23]、蛋白質(zhì)修飾[24]、化學還原[25]和聚乙二醇化[26]，可改善GO與生物分子之間的親和力。

GO的氨基化對酶的穩(wěn)定性有積極的影響，相比于GO，GO-NH對酶活性的影響更小。固定化酶的催化行為與其α-螺旋含量有關，α-螺旋含量是酶正確折疊的良好指標，雖然完整的α-螺旋結構并不能保證酶的活性，但這種二級結構元素的丟失通常會導致酶失活。Stamatis等[27]對比分析了脂肪酶固定在GO表面和氨基化GO表面時酶的α-螺旋含量，直接固定在GO表面，脂肪酶α-螺旋含量下降，而固定在氨基化GO表面時，脂肪酶α-螺旋含量卻增加。氨功能化會在GO表面形成隔離層，減少載體的聚集，也有助于避免酶與載體的剛性碰撞。此外，氨功能化提高了GO表面的親和性并引入大量氨基，有助于后續(xù)修飾過程的進行，也中和了GO的負電荷，減小了靜電相互作用對酶活性的影響[28]。親和固定可以避免隨機固定化引起的構象變化，從而保證了酶的活性[29]。

牛血清白蛋白(BSA)通常用于控制蛋白質(zhì)與各種固體表面的粘附，通過對BSA殘基的化學修飾，控制其在GO表面的吸附，為酶在GO表面的結合提供了有利條件。Kumar等[30]將高度陽離子化的牛血清白蛋白(cBSA)吸附于GO表面，有效維持與GO結合后酶的結構和活性，GO經(jīng)過cBSA修飾后，表面親和力提高，可以有效保持固定化酶的活性，GO表面cBSA吸附量越多，載體對酶活的影響越小。

還原氧化石墨烯(RGO)是由GO經(jīng)過反應去除一些氧化的官能團得到的，RGO有高比表面積、低電導率、高缺陷和親水性等特性[31]。GO和RGO在不修飾或使用偶聯(lián)劑的情況下，依靠氫鍵、靜電、疏水、弱范德華力、π-π相互作用以及共價相互作用可以直接固定蛋白質(zhì)，但這些相互作用會影響蛋白質(zhì)的構象、活性和穩(wěn)定性[20，25]。Yang等[19]比較了GO和RGO對溶菌酶構象和活性的影響。相較于RGO，GO對酶活性的抑制更為嚴重，而RGO對酶活性幾乎沒有影響；GO和RGO對溶菌酶活性的不同影響是由于它們誘導了酶構象發(fā)生了不同的變化；GO固定溶菌酶，降低了α-螺旋含量，酶二級結構喪失，活性位點暴露于水環(huán)境中，導致酶失活。RGO固定溶菌酶，α-螺旋含量卻略有增加，表明RGO對溶菌酶的生物相容性高于GO。

聚乙二醇(PEG)是一種水溶性聚合物，被用于許多藥物和生物技術應用中生物大分子和表面的修飾，作為一種間隔物，可以保護酶免受變性作用[26]。Wang等[32]合成了一種新型磁性多臂納米復合材料GO@Fe3O4@6arm-PEG-NH2，并進行HRP的固定化研究，與游離酶相比，固定化HRP的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均有提高；經(jīng)8次循環(huán)后，固定化HRP的活性仍在68.1%以上。

2.2 包覆-吸附法對溶菌酶吸附量及酶活性的影響

包覆-吸附法也可以改善GO對酶的活性和穩(wěn)定性的影響。Luo等[33]提出了一種原位自由基聚合技術與非共價吸附方法相結合的雙固定化酶的方法，可有效提高酶的活性和穩(wěn)定性。通過原位自由基聚合法在酶表面包裹N-烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)單體聚合物殼，形成帶正電荷的NOPH10納米球，可穩(wěn)定酶的構象并保護其結構在固定化過程中不變形；同時該殼層結構可保護酶結構免受熱效應的影響，提高酶的熱穩(wěn)定性。Griebenow等[34]研究了化學糖基化對酶在GO納米片上固定后穩(wěn)定性的影響。膽紅素氧化酶(BOD)共價連接葡聚糖生成糖基化BOD，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結構，用GO固定糖基化BOD時，酶結構基本不變。糖基化通過限制蛋白質(zhì)遷移率來增加穩(wěn)定性，有助于生成高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-GO生物結合物，用于生物納米技術領域。

2.3 共混對溶菌酶吸附量及酶活性的影響

殼聚糖、海藻酸鈉、明膠等天然高分子材料是酶固定化研究中常用的傳統(tǒng)載體，具有良好的生物相容性，可延長酶的壽命，提高酶的穩(wěn)定性。GO和天然高分子材料的復合物可作為一種生物友好的生物相容性界面，用于固定生物分子，為生物分子提供良好的微環(huán)境，并有效地保持其活性[35-36]。GO表面的靜電荷會使其聚集，用殼聚糖、海藻酸鈉等材料與GO共混能防止GO聚集，增強其穩(wěn)定性[37]。通過靜電層層自組裝、化學沉淀法、靜電液滴法、自由基聚合法等方法，天然高分子材料與GO可以形成微球、納米粒子、復合膜水凝膠、復合膜等復合材料，以這些復合材料為載體，不僅可以提高酶的吸附量，還可以提高固定化酶的活性、穩(wěn)定性和重復利用性[36，38]。Xue和Wang[39-40]分別測試了新型羧甲基殼聚糖-GO雜化顆粒和功能性胍離子液體包覆的磁性殼聚糖GO對蛋白質(zhì)的吸附性能，發(fā)現(xiàn)兩種復合材料對溶菌酶均有良好的吸附性。He等[38]將GO包裹在海藻酸鈉中，制備了鈣離子交聯(lián)的海藻酸鈉/GO復合凝膠珠(Ca-SA/GO)，并將其用于對溶菌酶的吸附。GO的濃度越高，Ca-SA/GO對溶菌酶的吸附能力越好；CA-SA/GO經(jīng)3個循環(huán)使用后，對溶菌酶的吸附能力仍保持在80%以上。Ca-SA/GO具有良好的穩(wěn)定性、吸附能力和再生能力，是一種很有前途的溶菌酶吸附劑。

2.4 位點特異性固定對溶菌酶吸附量及酶活性的影響

GO固定溶菌酶導致酶失活的主要原因是酶構象的改變以及活性位點無法到達底物。位點特異性共價固定，允許酶以確定的、可控的方式排列，通過形成親和鍵來改善一些缺點。GO經(jīng)表面修飾之后，可以避開酶的活性位點，實現(xiàn)定向固定化酶，減少對酶活的損失。Bundy等[41]在不同條件下，將T4溶菌酶分別固定在離活性位點近和遠位置，比較了兩種情況下酶的活性和穩(wěn)定性。結果表明，定向共價固定化酶的活性和穩(wěn)定性超過傳統(tǒng)隨機共價固定化酶。經(jīng)過嚴格的凍融三次和化學變性處理后，位點特異性固定化酶的活性比隨機固定化酶高50%和73%。酶的定向固定在酶活性和穩(wěn)定性中起著重要作用，通過控制酶的固定化取向，可避免載體與酶活性位點的之間接觸并有效降低固定酶活性位點的空間位阻效應，提高酶的活性和穩(wěn)定性。

3 結 語

固定化酶有效提高了酶的穩(wěn)定性和重復利用率，在眾多工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，有利于酶的工業(yè)化，是酶工程領域的研究熱點[42]。用GO直接固定溶菌酶，會導致酶結構的變化，影響酶的催化活性，但通過GO表面的氨基化、生物膠修飾、化學還原、聚乙二醇化等功能化修飾，可明顯改善其表面的生物相容性，調(diào)控與酶之間的相互作用，減小對溶菌酶構象和活性的影響；通過氧化石墨與天然高分子材料的共混，形成具有生物相容性界面的復合材料，有效保持了溶菌酶在固定化后的酶活；GO或溶菌酶通過包覆-吸附的方式，可有效避免酶與載體的直接接觸所導致的酶活損失；位點特異性固定避開了酶的活性位點，避免了固定化過程對酶活性的影響。

GO具有多種優(yōu)良的特性，在食品、生物醫(yī)藥、生物傳感器、紡織品、酶固定等領域應用廣泛，未來，要繼續(xù)開發(fā)既能提高酶吸附量，又能提高酶活性的改性GO材料以及GO的復合材料，進一步推進GO在固定化酶領域的應用。