王潞娜，王紅芳，柴青葉，申曉婷，宋小飛，張輝

山西振東制藥股份有限公司，山西 長治 047100

前列腺癌是一種常見的在男性泌尿生殖系統(tǒng)中的惡性腫瘤，該病的發(fā)生與性激素、遺傳等因素密切相關(guān)，中老年前列腺癌的發(fā)病率較高，可隨著病情的進(jìn)展演變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔╩CRPC），嚴(yán)重增加了治療難度［1］。而醋酸阿比特龍（abiraterone acetate）是一種不可逆靶向細(xì)胞色素酶P450（CYP）17 抑制劑［2-6］，臨床上主要用于治療既往接受含多烯紫杉醇（多西他賽）治療的mCRPC 患者，單獨(dú)使用時(shí)，具有選擇性強(qiáng)、親和力好、活性高的特點(diǎn)，可使mCRPC 患者臨床獲益，是目前歐美國家臨床治療mCRPC 的一線治療藥物。其與潑尼松聯(lián)合治療mCRPC 患者［7］，使患者的總生存期延長4.4 個(gè)月，且不良反應(yīng)率顯著降低且可控［8-11］。2018 年國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了新適應(yīng)證，與潑尼松或潑尼松龍合用可明顯延長患者總生長期，治療新診斷的高危轉(zhuǎn)移性內(nèi)分泌治療敏感性前列腺癌（mHSPC）［12］，現(xiàn)已成為治療晚期前列腺癌首選藥物之一。

由醋酸阿比特龍?jiān)纤幮再|(zhì)及其合成工藝路線可知，原料需要研究的雜質(zhì)包括：雜質(zhì)A（氧化雜質(zhì)）、雜質(zhì)B（M3 傳遞）、雜質(zhì)C（氧化/光照降解雜質(zhì)）、雜質(zhì)D（氧化/光照降解雜質(zhì)）、雜質(zhì)E（CSA-M3 剩余）、雜質(zhì)F（異構(gòu)體）、雜質(zhì)G（與乙酸丙酸酐發(fā)生副反應(yīng)）。

目前醋酸阿比特龍?jiān)媳幻绹幍洌║SP43-M38）收錄［13］，美國藥典僅控制了雜質(zhì)A、B、C、D、E，鑒于對原料藥的雜質(zhì)譜研究尚不全面，本研究采用USP 方法對其進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)色譜峰存在分離度差、峰型不佳、基線噪聲大等問題，故在美國藥典基礎(chǔ)上對其方法進(jìn)一步優(yōu)化，并根據(jù)ICHQ2(R1)分析方法驗(yàn)證正文和方法學(xué)指導(dǎo)原則、中國藥典2020 年版四部通則9101《分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證［14］，證明該方法能有效評價(jià)醋酸阿比特龍質(zhì)量，同時(shí)為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260 HPLC，DAD，美國安捷倫科技公司）；電子天平（TB-215D，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；超純水機(jī)（Milli-Q，IQ7000，默克密理博merck）；ProntoSIL C18 色譜柱（3 mm×150 mm，3 μm，德國BISCHOFF）、Acclaim TMPolar Advantage Ⅱ（3 mm×150 mm，3 μm，德國BISCHOFF）。

1.2 試藥

醋酸阿比特龍，批號：2109201、2210201、2211202、2212203，山西振東泰盛制藥有限公司；乙酸銨（色譜級），上海阿拉丁生物科技有限公司；乙腈（色譜純），北京伊諾凱科技有限公司；無水乙醇（色譜純），默克股份兩合公司；氫氧化鈉（分析級），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；30%雙氧水（分析級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雜質(zhì)A 對照品（含量：97.3%，批號：LC-ABL-009，深圳市靈凌生物科技有限公司）；雜質(zhì)B 對照品（含量：99.7%，批號：21155959A-WA-011，STD）；雜質(zhì)C 對照品（含量：96.5%，批號：LC-ABL-15，深圳市靈凌生物科技有限公司）；雜質(zhì)D 對照品（含量：95.8%，批號：2904-034AL，TCL）；雜質(zhì)E 對照品（含量：99.9%，批號：WRS-CSA-M3-2111-041，自制）；雜質(zhì)F 對照品（96.7%，批號：LC-ABL-006，深圳市靈凌生物科技有限公司）；雜質(zhì)G 對照品（含量：96.5%，批號：WRS-CSA-APIi3-2111-044，自制）；醋酸阿比特龍對照品（含量：96.8%，批號：R078C0，USP Authoried Distributors）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以ProntoSIL C18（3 mm×150 mm，3 μm）為色譜柱；以10 mmol/L 乙酸銨-乙腈（95∶5）為流動(dòng)相A；以乙腈為流動(dòng)相B；乙醇為流動(dòng)相C；流速為0.35 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為15 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；按下表進(jìn)行梯度洗脫（見表1）。

表1 梯度洗脫程序

圖1 醋酸阿比特龍及雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 溶液配制

雜質(zhì)A 對照品母液：取雜質(zhì)A 對照品約2 mg，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻（濃度約為100 μg/mL）；同法配制雜質(zhì)B、C、D、E、F、G 對照品母液。

雜質(zhì)A 對照品溶液：精密量取雜質(zhì)A 對照品母液1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為10 μg/mL）；同法配制雜質(zhì)對照品溶液B、C、D、E、F、G。

系統(tǒng)適用性溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加乙腈適量使溶解，精密加入雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 對照品溶液各1 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（樣品濃度約為1 mg/mL、各雜質(zhì)濃度約為1 μg/mL）。

供試品溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 μg/mL）。

2.3 系統(tǒng)適用性

取系統(tǒng)適用性溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，詳見圖2。由圖譜可知，醋酸阿比特龍與相鄰雜質(zhì)峰之間、7 個(gè)已知雜質(zhì)與相鄰雜質(zhì)峰之間分離度均大于2.0；主峰理論板數(shù)按醋酸阿比特龍計(jì)算為67 611，不低于5 000；醋酸阿比特龍及7 個(gè)已知雜質(zhì)拖尾因子均小于1.5。

2.4 專屬性

未破壞供試品溶液：配制同“2.2”項(xiàng)下供試品溶液。酸破壞溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加3 mL 乙腈使溶解，精密加入1 mol/L 鹽酸溶液0.5 mL，于室溫條件下放置8 h，精密加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液0.5 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。同法配制相應(yīng)空白溶液。酸破壞溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加3 mL 溶劑使溶解，精密加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液0.5 mL，于室溫條件下放置1 h，精密加入1mol/L 鹽酸溶液0.5 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。同法配制相應(yīng)空白溶液。氧化破壞溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加3 mL 溶劑使溶解，精密加入30%過氧化氫溶液1 mL，于50 ℃水浴鍋中放置5 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。同法配制相應(yīng)空白溶液。光照破壞溶液：取樣品適量，置扁形瓶中平鋪，厚度約5 mm，于可擴(kuò)展試驗(yàn)箱（5 000 Lx，0.9 wh·m-2）中放置10 d，取出置干燥器中；臨用前，取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。高溫破壞溶液：取樣品適量，置扁形瓶中平鋪，厚度約5 mm，于105 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中放置8 h，取出置干燥器中，放冷至室溫；取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。

按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣檢測，記錄各破壞條件下典型圖譜。結(jié)果表明：樣品在光照、高溫2 個(gè)條件下相對穩(wěn)定，總雜含量及雜質(zhì)個(gè)數(shù)無明顯變化；在酸、堿、氧化3個(gè)條件下相對不穩(wěn)定，均有降解雜質(zhì)生成，各降解雜質(zhì)峰與主峰之間分離度均大于2.0，且能達(dá)到完全分離。

2.5 靈敏度

混合對照品溶液：取醋酸阿比特龍對照品，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 對照品適量，加乙腈溶解稀釋制成10 μg/mL 的混合溶液。

取混合對照品溶液逐步稀釋制成一定濃度的溶液按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣檢測，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 及主成分定量限（LOQ）測定結(jié)果分別為0.50 ng、0.31 ng、3.11 ng、2.92 ng、0.81 ng、0.99 ng、0.80 ng、0.49 ng，檢測限（LOD）測定結(jié)果分別為0.20 ng、0.13 ng、1.24 ng、1.17 ng、0.33 ng、0.40 ng、0.32 ng、0.20 ng；LOQ 溶液重復(fù)進(jìn)樣6 針，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 及主成分峰面積RSD 分別為4.02%、3.87%、6.47%、2.12%、5.47%、3.53%、5.14%、7.59%；保留時(shí)間RSD分別為0.17%、0.11%、0.07%、0.05%、0.08%、0.07%、0.13%、0.11%，結(jié)果表明靈敏度良好。

2.6 線性與范圍

線性1～6 溶液：取醋酸阿比特龍對照品、雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 對照品適量，加乙腈溶解并制成0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0 μg/mL 一系列溶液。主成分及各已知雜質(zhì)以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程和回歸方程相關(guān)系數(shù)r，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算校正因子，結(jié)果見表2。

表2 醋酸阿比特龍及雜質(zhì)A～G線性結(jié)果

2.7 回收率

將雜質(zhì)限度作為100%點(diǎn)，測試50%、100%、150%3 個(gè)不同濃度點(diǎn)回收率；各雜質(zhì)對照品溶液按“2.2”項(xiàng)下溶液配制方法制備；供試品溶液配制同“2.2”項(xiàng)下。

取樣品約10 mg，置10 mL 量瓶中，加適量溶劑溶解，分別精密加入“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)對照品溶液適量，加乙腈稀釋至刻度，搖勻（每個(gè)濃度平行配制3 份）。結(jié)果：雜質(zhì)A 回收率為99.03%～103.92%，RSD 為1.84%；B 回收率為100.67%～106.00%，RSD為1.96%；C 回收率為91.49%～104.26%，RSD 為4.35%；D 回收率為98.70%～105.88%，RSD 為2.23%；E 回收率為96.08%～102.97%，RSD 為2.26%；F 回收率為94.00%～102.00%，RSD 為2.46%；G 回收率為96.18%～101.92%，RSD 為1.79%；9 份回收率溶液RSD 均小于5.0%，均符合要求。

2.8 重復(fù)性

照“2.2”項(xiàng)下平行配制6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，計(jì)算各雜質(zhì)含量。雜質(zhì)E、F、G 校正因子的值均在0.9～1.1 之間，雜質(zhì)A、B 校正因子均小于0.9，故均采用不加校正因子主成分自身對照法；雜質(zhì)C、D 校正因子均大于1.1（見表2），故均采用加校正因子主成分自身對照法。結(jié)果雜質(zhì)F 未檢出、雜質(zhì)A、B、C、D、E、G 含量均值分別為0.004%、0.001%、0.016%、0.005%、0.008%、0.010%，RSD 值分別為5.22%、3.92%、3.43%、4.83%、4.10%、3.82%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 中間精密度試驗(yàn)

于不同日期、不同人員、采用不同儀器、重復(fù)“2.8”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)。2 位分析人員，12 份供試品溶液結(jié)果統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，雜質(zhì)F 未檢出、雜質(zhì)A、B、C、D、E、G 含量均值分別為0.004%、0.001%、0.015%、0.005%、0.009%、0.011%，RSD 值分別為5.18%、3.87%、3.52%、4.62%、4.23%、3.79%，表明方法精密度良好。

2.10 溶液穩(wěn)定性

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h 進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖；結(jié)果顯示，雜質(zhì)F 未檢出，雜質(zhì)A、B、C、D、E、G 不同時(shí)間點(diǎn)供試品溶液中各雜質(zhì)含量均值分別為0.004%、0.002%、0.014%、0.003%、0.006%、0.014%；RSD 值分別為4.96%、3.95%、3.62%、4.72%、4.03%、3.89%，表明供試品溶液在室溫條件下42 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 耐用性

取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，通過改變柱溫（±2 ℃）、流速（±0.05 mL/min）、波長（±2 nm）、鹽濃度（±1%）、不同品牌色譜柱（AcclaimTM Polar Advantage Ⅱ，3 mm×150 mm，3 μm）等不同參數(shù)，對分析方法的耐用性進(jìn)行評估；結(jié)果表明，對方法參數(shù)進(jìn)行改變后，方法依然有效。

2.12 樣品檢測

取3 批不同批次原料藥，按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液和對照溶液，依法檢測，檢測結(jié)果見表3。

表3 醋酸阿比特龍有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果 %

3 討論

3.1 校正因子參與計(jì)算的意義

對于特定雜質(zhì)的控制，校正因子的研究和測定是非常必要的，它起到有效的校準(zhǔn)作用，保證了雜質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。校正因子的確定可采用單濃度點(diǎn)、多濃度點(diǎn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和吸收系數(shù)比值法等計(jì)算。本研究中HPLC 測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其校正因子，利用線性方程中雜質(zhì)斜率除以主成分斜率來計(jì)算各雜質(zhì)的校正因子，同時(shí)還應(yīng)該更換不同人員、于不同日期、采用不同儀器測試2 次，2 次的結(jié)果偏差不大于10%。如果校正因子數(shù)值在0.9～1.1，雜質(zhì)計(jì)算時(shí)可采用不加校正因子主成分自身對照計(jì)算；當(dāng)其大于1.1，小于0.9 時(shí)，雜質(zhì)計(jì)算采用加校正因子主成分自身對照法計(jì)算。

3.2 流動(dòng)相體系的優(yōu)化

重現(xiàn)美國藥典USP43-NF38 項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)色譜條件，檢測發(fā)現(xiàn)該方法無法將雜質(zhì)B、C 有效分離，且雜質(zhì)A、E 峰型較差，在優(yōu)化方法時(shí)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相A 組分及流動(dòng)相洗脫比例對主峰及各雜質(zhì)峰型、塔板數(shù)、拖尾因子有顯著影響，故通過將流動(dòng)相A10 mmol/L乙酸銨更換為10 mmol/L 乙酸銨-乙腈（95∶5），且優(yōu)化流動(dòng)相洗脫比例，結(jié)果表明主成分及各雜質(zhì)峰形、保留時(shí)間及各雜質(zhì)分離情況均符合要求。

3.3 檢測波長的確定

取樣品（批號：2109201）與雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 適量，使用DAD 檢測器，在190 nm～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，樣品與各已知雜質(zhì)均在254 nm 波長處有較大吸收，因此選擇254 nm 為本方法檢測波長。

3.4 雜質(zhì)限度的確定

參考美國藥典USP43-NF38 雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)際檢測結(jié)果，制定各雜質(zhì)的限度標(biāo)準(zhǔn)。美國藥典2023年版規(guī)定各已知雜質(zhì)限度為0.1%，均未對未知雜質(zhì)及總雜限度進(jìn)行規(guī)定，參考ICH 指導(dǎo)原則，根據(jù)每天攝入新原料藥的量及生產(chǎn)安全嚴(yán)格質(zhì)控，擬定各已知雜質(zhì)的限度不得過0.1%，未知單個(gè)雜質(zhì)限度不得過0.10%，總雜質(zhì)限度不得過3.0%。

4 小結(jié)

綜上可知，該方法經(jīng)分析方法驗(yàn)證，表明本方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果可靠、適用于醋酸阿比特龍?jiān)现? 種有關(guān)物質(zhì)檢測，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及安全生產(chǎn)提供了有效的技術(shù)保障。