劉小麗

食品安全國家標準《水果和蔬菜中阿維菌素殘留量的測定液相色譜法》（GB23200.19—2016）中介紹的檢測方法，前處理復雜，分析時間長，且在實際檢測過程中容易出現(xiàn)回收率低、檢出限低、精密度差等問題。本文討論了用液相色譜法檢測菠菜中阿維菌素時的一些問題，這些問題對試驗結(jié)果的回收率、穩(wěn)定性、檢出限、精密度會產(chǎn)生影響。針對上述問題展開方法優(yōu)化與結(jié)果研討，方法改進后，提高了檢測方法的準確性和精密度。

一、材料與方法

（一）儀器

電子分析天平、振蕩器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀、渦旋混合器、固相萃取柱SPE C18、安捷倫1260高效液相色譜儀配紫外檢測器。

（二）試劑

丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）。

（三）標準溶液

標準溶液由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所提供，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1。檢測時，阿維菌素標準工作液用甲醇稀釋至10.0 μg·mL-1。

（四）儀器工作條件

色譜柱為4.6 mm×125 mm安捷倫ODS-C18反相柱，流動相為甲醇：水=90：10，流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為245 nm，柱溫為40℃，進樣量為20 μL。

二、結(jié)果與分析

（一）前處理條件優(yōu)化

試樣稱取20 g，用丙酮提取，濃縮后殘渣太多；用布氏漏斗抽濾，每個樣品需要清洗布氏漏斗，增加清洗工作量且易使樣品交叉污染；蔬菜、水果含水量比較高，40 ℃溫水旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL，濃縮到最后基本都是水。

1.樣品稱取量及提取溶劑、提取方法的選擇。試樣稱取20.0 g和10.0 g，分別選擇了乙腈、乙酸乙酯和丙酮3種提取溶劑。回收率與稱樣量沒有直接關系，三種提取溶劑回收率分別為 56.9%、89.2%、93.8%。選擇稱取試樣量10.0 g，丙酮作為提取劑。

參考有關阿維菌素的提取方法相關文獻報道，分別采用了離心、高速勻漿、超聲三種提取方式。根據(jù)實驗結(jié)果選擇了超聲提取 30 min后，于 4500 r·min-1條件下離心 5 min，待凈化。

濃縮方法參考相關資料，分別比較了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹。根據(jù)實驗結(jié)果，兩種濃縮方法回收率分別為79.4%、95.7%，氮吹回收率相對較高。

2.樣品凈化過程中沒有具體說明如何完全將濃縮提取液轉(zhuǎn)入SPE C18柱。如果不潤洗，回收率很低。本方法采用6 mL丙酮分3次潤洗轉(zhuǎn)入SPE C18柱，再用5 mL的水淋洗，去掉淋洗液。最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹至近干。

（二）樣品制備和標樣的添加

菠菜先切碎，再勻漿處理。在純菠菜漿中添加阿維菌素標準溶液，分別添加質(zhì)量濃度至 0.005 mg·kg-1、0.01 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1，每個濃度重復 6 次，待其平衡1 h后進行樣品提取。

（三）樣品的提取、凈化

菠菜樣品稱取 10.0 g，加入10 mL丙酮溶液超聲提取 30 min，4500 r·min-1條件下離心5 min。取4 mL上清液于45℃條件下氮吹濃縮至2 mL，用6 mL丙酮分3次潤洗轉(zhuǎn)入SPE C18柱，再用5 mL的水淋洗，去掉淋洗液。最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹至近干。準確加入1.0 mL甲醇溶解殘渣，渦旋振蕩1 min后靜置30 min，吸取上清液過0.22μm濾膜過濾，于進樣小瓶中保存，供液相色譜測定。

（四）標準曲線

校準曲線配制選擇10.0μg·mL-1阿維菌素標準工作液，用甲醇做溶劑，配制5個濃度水平分別為0.005μg·mL-1、0.01μg·mL-1、0.05μg·mL-1、0.10μg·mL-1、0.20μg·mL-1 的標準工作溶液，配制完成后上機測定峰面積和保留時間。以峰面積為縱坐標，以進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線（見圖1）。標準曲線的相關系數(shù)為0.999 5以上，符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 ?食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）標準要求。為加標色譜圖農(nóng)藥殘留量回收率判定提供了較好的依據(jù)。

（五）方法的準確性、精密度和檢出限

根據(jù)試驗檢測結(jié)果表明，阿維菌素的保留時間為 32 min時峰形對稱性良好。以外標法定量阿維菌素峰面積（y）與質(zhì)量體積濃度（x）呈良好線性相關，線性回歸方程為 y =5 7663x-14.334 ，相關系數(shù)（R2）為 0.999 5。

檢出限指用某一方法可定性檢測到樣品中殘留物的最小濃度，該水平信噪比一般為3 ，阿維菌素檢出限為 0.002 ng·μL-1 時靈敏度高。

定量限指可以對基質(zhì)中目標殘留物進行準確定量測定的最低水平，在該水平下得到的回收率和精密度應滿足分析的要求，添加標準溶液質(zhì)量濃度得到的信噪比一般為10，本試驗添加回收率條件下，顯示阿維菌素峰形及重現(xiàn)性較好且無雜質(zhì)干擾，阿維菌素在菠菜中的定量限為 0.005 mg·kg-1，低于阿維菌素在菠菜中的最大殘留限量。

阿維菌素在菠菜中的平均回收率為 93.8%～97.2%，相對標準偏差為 5.5%～8.0%，添加濃度包含定量限，最大殘留限量值，添加濃度能覆蓋本殘留試驗中所有樣品最高殘留量，且不同添加濃度均符合回收率要求，用回收率試驗的相對標準偏差衡量檢測方法的精密度，不同添加濃度對相對標準偏差均符合要求（見表1）。

三、影響準確度與精密度的原因及解決方法

（一）色譜柱

當色譜柱污染后，峰面積會隨著測定次數(shù)的增加而增加，影響測定結(jié)果的RSD值。實驗過程中要確保色譜柱的干凈程度，特別在進行比對時，要用干凈的色譜柱。

（二）基質(zhì)效應

同一種農(nóng)藥在不同蔬菜中有不同程度的基質(zhì)效應，為了準確定量，理論上每種基質(zhì)都需要制作對應的基質(zhì)匹配標準曲線。為減少工作方法的工作量，在不影響結(jié)果準確性的前提下，選擇一種有代表性的基質(zhì)作為通用基質(zhì)。

（三）注意事項

為保證數(shù)據(jù)準確，在操作過程中還要注意以下幾方面。

1.清液移取4 mL前，用該液潤洗3次移液管，保證吸取刻度準確。

2.氮吹時氣流大了容易把液體吹出造成損失，氣流太小氮吹時間延長，影響回收率。氮吹近干要求小燒杯內(nèi)壁有潮潮的一層，吹干后回收率小。氮吹過程中要用干凈濾紙擦去針頭上的水珠，防止水珠落入瓶中氮吹不準確，影響結(jié)果。

3. SPE C18柱使用前用 5 mL 甲醇和 5 mL 水活化，凈化時小柱不能干，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即倒入凈化溶液。小柱干了不容易洗脫，影響回收率。

四、結(jié)論

液相色譜法稱取試樣10 g，采用超聲提取，凈化濃縮處理后，采用高效液相色譜法測定阿維菌素的檢出限為 0.002 ng·μL-1，定量限為 0.005 mg·kg-1。樣品添加質(zhì)量濃度分別為0.005 mg·kg-1、0.01 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1，每個濃度重復 6 次，添加回收率為 92.5%～96.7%，相對標準偏差小于7.2%。此方法試驗步驟操作簡單，靈敏度高，經(jīng)添加回收率試驗表明得出的回收率、重復性均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，適用于水果、蔬菜中阿維菌素的批量檢測。

（責任編輯 ? 程麗紅）