陳 盛

（上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201114）

氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯均屬于廣譜類殺菌劑。氟吡菌胺，化學(xué)式為C14H8Cl3F3N2O，被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物中卵菌門真菌引起的霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等重要病害的防控[1]。氟吡菌酰胺，化學(xué)式為C16H11ClF6N2O，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物中霜霉病、菌核病和葉斑病等病害的防控[2]。螺蟲乙酯化學(xué)式為C21H27NO5，可用于防治農(nóng)作物、果樹和蔬菜中的蚜蟲、木虱和蚧科等刺吸式口器害蟲[3]。該類型殺菌劑可通過污染土壤、水體等對畜禽養(yǎng)殖、人類生存環(huán)境及生命健康造成一定程度的影響。我國在最新實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）[4]中明確動(dòng)物性食品中這3種殺菌劑的最大殘留限量為0.01 mg·kg-1。

目前，國內(nèi)關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留的檢測方法主要為色譜法[5-6]、質(zhì)譜法[7-10]、QuEChERS-結(jié)合質(zhì)譜法[11-14]，尚無關(guān)于動(dòng)物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯同時(shí)使用QuEChERS-結(jié)合質(zhì)譜檢測的方法。本次研究擬以乙腈為提取液，采用QuEChERS法凈化樣品，用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量進(jìn)行測定，為日常開展相關(guān)檢測、標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，購自上海盒馬生鮮超市；牛肉，購自上海盒馬生鮮超市。

甲酸、乙酸銨、乙腈，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氯化鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100.10±0.03）μg·mL-1，北京振翔科技有限公司；氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000.5±3.0）μg·mL-1，北京振翔科技有限公司；螺蟲乙酯（101.20±0.05）μg·mL-1，阿爾塔科技有限公司；CNW SPE 基質(zhì)分散固相萃取純化管，150 mg MgSO4，50 mg PSA，2 mL/100 pcs，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：BP211D，德國Sartorius公司；高速冷凍離心機(jī)：Sovall ST16R，美國ThermoFisher公司；漩渦振蕩器：Basic Vortex Mixer，美國Talboys公司；氮吹儀：DC-24，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；高速均質(zhì)機(jī)：T18 digital ULTRA TURRAX，德國IKA公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1290+6470，美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取及凈化

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的肌肉組織樣品10 g（精確到0.01 g）放入50 mL離心管，加入20 mL乙腈溶液，加入3～5 g無水硫酸鈉于離心管中，使用高速均質(zhì)機(jī)對樣品均質(zhì)1 min，后將離心管置于渦旋振蕩器上繼續(xù)劇烈振蕩提取5 min，并離心10 min（4 ℃、8 000 r·min-1）。移取乙腈層至另一離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，于渦旋振蕩器上繼續(xù)劇烈振蕩后，以8 000 r·min-1速率離心5 min，棄去正己烷，乙腈層待凈化。

吸取10 mL乙腈轉(zhuǎn)移至SPE基質(zhì)分散固相萃取純化管中，渦旋混勻3 min，以8 000 r·min-1速率離心5 min。吸取上清液至試管中，在50 ℃條件下，氮吹吹至近干，用1∶1乙腈水溶液定容，過0.22 μm濾膜過濾，待上質(zhì)譜分析。

1.3.2 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液（含10 mmol乙酸銨）；流動(dòng)相B：乙腈。液相流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。流動(dòng)相流速0.3 mL·min-1；柱溫箱溫度40 ℃。

表1 液相流動(dòng)相梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電噴霧正離子源（ESI+）；離子源溫度：150 ℃；電噴霧電壓：1.3 kV；毛細(xì)管電壓：4 kV；正離子掃描及多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：10 L·min-1；加熱氣流量：10 L·min-1；脫溶劑氣溫度：350 ℃；霧化氣壓力：40 psi。直接進(jìn)樣氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，獲得3種農(nóng)藥的母離子分別為m/z383.0、397.1及374.1，后進(jìn)一步進(jìn)行離子掃描，分別得到定性離子及定量離子，通過質(zhì)譜條件優(yōu)化，得到最佳檢測靈敏度，最終結(jié)果具體數(shù)值詳見表2。

表2 氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別準(zhǔn)確稱取氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容，得到濃度為100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于-18 ℃冰箱備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1 μg·mL-1）：分別用移液管準(zhǔn)確吸取0.50 mL氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。保存于4 ℃冰箱，有效期為7 d。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確稱取7份不含3種待測農(nóng)藥的空白實(shí)驗(yàn)樣品于50 mL離心管中，經(jīng)樣品前處理后，用得到的空白基質(zhì)溶液配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均分別為2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取甲醇和乙腈作為提取試劑，氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯均可溶于上述2種有機(jī)試劑。通過在空白基質(zhì)中添加氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，并使用這2種試劑進(jìn)行提取，考察其樣品回收率。結(jié)果顯示，乙腈提取回收率為95%，甲醇提取回收率為92%。這2種試劑均能達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求，實(shí)現(xiàn)3種農(nóng)藥的有效提取。其中，乙腈可以起到沉淀樣品中蛋白質(zhì)的作用，且從樣品中提取出的色素、脂肪較少，綜合考慮提取效果及回收率，選擇乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化方式的選擇

凈化是樣品前處理中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選取合適的凈化方式能夠有效去除基質(zhì)中的雜質(zhì)，縮短凈化時(shí)間，有效富集被測物，大大提高檢測靈敏度。在檢測動(dòng)物源性樣品中的農(nóng)藥殘留時(shí)，提取液中的脂肪、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)可能會(huì)給質(zhì)譜檢測結(jié)果帶來很大的基質(zhì)干擾，從而影響檢測結(jié)果的靈敏度及準(zhǔn)確度。

本次分別使用固相萃取法和QuEChERS法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)兩種方法均能滿足這3種農(nóng)藥的檢測需求，其中固相萃取法回收率為82%，QuEChERS法回收率為85%。但QuEChERS法具有節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間、消耗有機(jī)試劑少、操作簡單的優(yōu)勢，故選用QuEChERS法作為本實(shí)驗(yàn)的凈化方法。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

稱取適量的氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度范圍在2～200 μg·L-1的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度（X，mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表3所示，相關(guān)系數(shù)均＞0.992，檢出限為0.01 mg·kg-1，定量限為0.03 mg·kg-1。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)法，選取豬肉、牛肉陰性樣品，分別添加0.03 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1及0.50 mg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測定6次，測定后得到氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯在兩種不同肉類基質(zhì)中的平均回收率為80.3%～94.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.3%～8.7%。由表4可知，該方法的準(zhǔn)確度及精密度符合農(nóng)藥殘留分析檢測的要求。

表4 氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差測定結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了LC-MS/MS同時(shí)測定豬肉、牛肉基質(zhì)中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量的方法。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，采用QuEChERS法凈化，以0.1%甲酸水溶液（含10 mmol乙酸銨）及乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，通過Poroshell 120 EC-C18液相柱分離，以電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測模式對目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析。該方法添加回收率在80.3%～94.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在4.3%～8.7%。實(shí)驗(yàn)證明該法在提高檢測效率、目標(biāo)物分離效果、精準(zhǔn)分析方面具有優(yōu)勢，完全可以滿足同時(shí)測定動(dòng)物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量的需求。同時(shí)，也可為在魚、蝦、蟹、雞肉等類似基質(zhì)樣品中的方法研究提供參考依據(jù)。