劉 軻，張芬鵲，賀 娜

（1.延安市食品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，陜西延安 716000；2.渭南市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，陜西渭南 714000；3.延安市藥品檢驗所，陜西延安 716000）

食品安全是公眾健康和社會穩(wěn)定的重要組成部分，而微生物污染是導(dǎo)致食品相關(guān)疾病和食品召回的主要原因之一[1]。因此，準確、高效地檢測食品中的微生物污染至關(guān)重要。隨著科學(xué)技術(shù)的進步，食品檢驗中的微生物檢測技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。食品中的微生物污染包括食源性病原菌、腐敗菌、病毒和寄生蟲等，它們可能導(dǎo)致食用者產(chǎn)生食物中毒、食源性感染和其他健康問題[2-3]。為了保障公眾的食品安全，食品行業(yè)和監(jiān)管機構(gòu)不斷探索和引入新的微生物檢測技術(shù)，以便及早發(fā)現(xiàn)和控制潛在的食品安全風(fēng)險。本論文旨在對食品檢驗中微生物檢測技術(shù)的應(yīng)用進行深入研究，關(guān)注各種微生物檢測方法的原理、流程和優(yōu)勢，并探討它們在食品檢驗中的具體應(yīng)用。通過深入了解微生物檢測技術(shù)的應(yīng)用，為食品行業(yè)和監(jiān)管機構(gòu)提供有價值的指導(dǎo)和決策支持，以確保食品的質(zhì)量和安全，保護公眾的健康。

1 食品安全與微生物污染的關(guān)系

微生物污染與食品安全密切相關(guān)，食品中存在的微生物可以引發(fā)食物中毒和傳染疾病。因此，對食品中的微生物進行檢測和控制非常重要。食品生產(chǎn)和加工過程中的衛(wèi)生管理、適當(dāng)?shù)募訜岷蛢Υ鏃l件以及微生物檢測技術(shù)的應(yīng)用都是確保食品安全的關(guān)鍵因素。以下是威脅食品安全的幾種微生物污染因素。

（1）食源性病原菌。食品中可能存在的病原菌包括沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌等，它們主要通過糞便污染食品或經(jīng)不潔的加工環(huán)境進入食物中，攝入食品中的病原菌可導(dǎo)致胃腸道疾病，引起腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀。

（2）腐敗菌和變質(zhì)標志物。食品腐敗常由細菌引起，如產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗酵母，它們會分解食品中的營養(yǎng)成分，產(chǎn)生惡臭氣味，并產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物。這些細菌和代謝產(chǎn)物可能會導(dǎo)致食品變質(zhì)，降低食品的質(zhì)量和營養(yǎng)價值。

（3）致病病毒和寄生蟲。除了細菌外，食品中也可能存在病毒和寄生蟲，如諾如病毒、肝炎病毒和鉤蟲。這些病原體可以通過未經(jīng)充分加熱處理的食品（如生肉、生蔬菜）傳播，攝入被感染的食物后，人體可能出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、黃疸等癥狀。

（4）毒素產(chǎn)生菌。一些細菌可以在食品中產(chǎn)生毒素，如產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的肉毒桿菌。這些毒素通常無法通過加熱殺滅，因此即使食物在烹飪過程中細菌被殺死，毒素仍可能存在，食用后可能導(dǎo)致嚴重的中毒癥狀。

2 微生物檢測技術(shù)方法及流程

2.1 微生物檢測技術(shù)方法

2.1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是最常用的微生物檢測技術(shù)之一。該技術(shù)需要將食品樣品在特定培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，并利用細菌、真菌和酵母等微生物的生長特性對樣本進行鑒定[4]。這種方法需要較長的培養(yǎng)時間（通常需要24～48 h或更長時間），但具有較高的特異性和可靠性。

2.1.2 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法利用微生物的DNA或RNA來進行檢測和鑒定。其中，聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是最常用的技術(shù)之一，它可以通過擴增微生物的基因片段快速檢測和定量微生物[5]。實時定量PCR是一種改進的PCR技術(shù)，可以實時監(jiān)測擴增反應(yīng)，從而提供更精確的結(jié)果。循環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種在恒溫條件下進行擴增的方法，具有較高的特異性和較快的檢測速度。

2.1.3 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法利用抗體與微生物的抗原結(jié)合進行檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種常用的免疫學(xué)方法，可以通過測量免疫反應(yīng)生成的信號來檢測微生物。另外，免疫層析試紙法是一種簡便快速的免疫學(xué)方法，通常用于現(xiàn)場快速檢測。

2.1.4 快速檢測技術(shù)

快速檢測技術(shù)結(jié)合了多種方法，旨在更快地提供檢測結(jié)果。其中，基于生物傳感器的檢測方法利用生物材料（如細胞、酶）與目標微生物的特定反應(yīng)來產(chǎn)生電信號或光信號，并通過傳感器檢測確定目標微生物的數(shù)量?；诩{米材料的檢測方法利用納米顆粒的特殊性質(zhì)，如表面增強拉曼散射（Surface Enhancement of Raman Scattering，SERS）或熒光增強效應(yīng)，以此來實現(xiàn)微生物的快速檢測。

2.2 微生物檢測流程

（1）進行樣品采集，從目標食品中采集代表性樣品，確保采集樣品時遵循衛(wèi)生規(guī)范，以防止交叉污染。

（2）對采集的食品樣品進行預(yù)處理，進行樣品的稀釋、浸泡、離心等，以去除可能存在的干擾物質(zhì)，如殘留農(nóng)藥、抑制物質(zhì)等。

（3）對樣品進行適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)處理，以增加微生物的數(shù)量，根據(jù)微生物的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)特征，使用適當(dāng)?shù)蔫b定方法來確定微生物的種類。如果需要更精確的檢測結(jié)果，可以使用分子生物學(xué)方法進行微生物檢測，包括DNA或RNA提取、PCR擴增、實時定量PCR等，也可以利用抗體與微生物的抗原結(jié)合來進行免疫監(jiān)測，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫層析試紙法等。

（4）根據(jù)檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析及解讀，根據(jù)相關(guān)標準或法規(guī)確定微生物數(shù)量是否符合安全要求。

（5）生成詳細的檢測報告，包括樣品信息、檢測方法、檢測結(jié)果和解讀以及可能的建議措施。

3 食品檢驗中微生物檢測技術(shù)的具體應(yīng)用

3.1 實時定量PCR檢測食源性病原菌

實時定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）檢測食源性病原菌具有高度敏感性、快速性、特異性、定量能力、自動化和高通量性、可靠性和重復(fù)性等優(yōu)勢。它能夠提供早期警示、多重檢測和檢測非活躍狀態(tài)的微生物，適用于各種食品樣品檢測，這使得qPCR成為食品檢驗中微生物檢測的重要工具，有助于確保食品安全，保護公共健康。

在實時定量PCR檢測食源性病原菌的過程中，首先根據(jù)檢測目的和特定要求，選擇要檢測的食源性病原菌。例如，選擇沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7或單核細胞增生李斯特菌等。從食品樣品中采集代表性樣品，并進行必要的預(yù)處理，包括樣品的稀釋、攪拌、研磨或其他樣品制備方法，以獲得合適的樣品溶液用于后續(xù)的DNA提取。使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒或其他適用的提取方法，從樣品中提取目標病原菌的DNA，對于RNA病原菌如諾如病毒，則需要進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，以便進行后續(xù)的PCR分析。

準備qPCR反應(yīng)體系，包括引物（特異性序列）和探針（通常帶有熒光標記），用于擴增和檢測目標病原菌的特定基因片段。確保控制組包括正控樣品（含有目標病原菌DNA的樣品）和負控樣品（不含目標病原菌DNA的樣品）。在qPCR儀器中運行反應(yīng)，并監(jiān)測熒光信號的增加情況，該信號與擴增的目標基因片段的數(shù)量成正比，通過相對定量或絕對定量方法，最終確定樣品中目標病原菌的數(shù)量。

根據(jù)標準曲線或已知濃度的參考樣品，將熒光信號轉(zhuǎn)化為目標病原菌的數(shù)量；根據(jù)設(shè)定的閾值，判斷樣品為陽性或陰性，并計算病原菌的濃度。生成詳細的監(jiān)測結(jié)果報告，其中包括樣品信息、檢測方法、檢測結(jié)果、病原菌的濃度等。如果檢測結(jié)果表明食品中存在食源性病原菌的污染，應(yīng)通過追溯措施來確定污染源，并采取適當(dāng)?shù)目刂拼胧?，以確保食品的安全性和質(zhì)量。

3.2 GC-MS技術(shù)檢測食品中的腐敗菌和變質(zhì)標志物

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技術(shù)是一種聯(lián)用技術(shù)，將氣相色譜（GC）和質(zhì)譜（MS）兩種分析技術(shù)結(jié)合在一起，用于分離、鑒定和定量分析復(fù)雜混合物中的化合物。GC-MS技術(shù)在食品中腐敗菌和變質(zhì)標志物的檢測中具有高靈敏度、高選擇性、定性定量分析的優(yōu)勢，能夠適應(yīng)不同類型的食品樣品檢測，提供快速分析結(jié)果，為食品安全和質(zhì)量控制提供了可靠的工具。

使用GC-MS技術(shù)檢測食品中的腐敗菌和變質(zhì)標志物時，首先需要收集食品樣品，如肉類、魚類、奶制品等，并進行適當(dāng)?shù)奶幚恚ㄇ懈?、研磨或溶解等），以便提取目標化合物。使用溶劑提取、脂肪提取或固相微萃取等技術(shù)，將目標化合物從食品樣品中提取出來；將提取得到的樣液注入GC系統(tǒng)中，GC利用樣品中化合物的揮發(fā)性差異將化合物分離出來。常用的氣相色譜柱包括非極性柱、極性柱或選擇性柱，根據(jù)目標化合物的特性進行選擇。通過與GC聯(lián)用的質(zhì)譜儀，對分離得到的化合物進行檢測和鑒定。將分離的化合物逐個引入質(zhì)譜儀，分析化合物的質(zhì)譜圖譜，每種化合物都具有獨特的質(zhì)譜圖譜，可與數(shù)據(jù)庫中的標準譜進行比對，以鑒定化合物的類別。根據(jù)GC-MS的結(jié)果，分析和解釋樣品中存在的化合物，通過比對標準庫中的譜圖確定化合物的身份和含量。

在監(jiān)測食品中的腐敗菌和變質(zhì)標志物時，GC-MS技術(shù)可以檢測和鑒定多種揮發(fā)性有機化合物（Volatile Organic Compounds，VOCs），如醛類、酮類、醇類、酸類和硫化合物等。這些化合物通常與食品的腐敗和變質(zhì)過程密切相關(guān)，通過分析這些化合物的質(zhì)譜圖譜可以大致確定食品樣品的腐敗程度和變質(zhì)狀態(tài)。

3.3 PCR/RT-PCR技術(shù)檢測食品中的病毒和寄生蟲

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是兩種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測和擴增DNA或RNA序列。它們在食品檢測中被廣泛應(yīng)用，具有高度敏感性、特異性和定量能力，能夠快速、準確地檢測和定量食品中的致病微生物或病原體。這些優(yōu)勢使得PCR/RT-PCR成為食品安全監(jiān)測和控制中不可或缺的工具。

通過PCR/RT-PCR方法檢測食品中的病毒和寄生蟲時，要從食品樣品中提取病毒核酸，并進行樣品處理。對食品樣品進行攪拌、離心和過濾等加工和處理，去除固體顆粒和雜質(zhì)，并提取病毒核酸。使用商業(yè)化的RNA/DNA提取試劑盒，按照廠家提供的指南進行操作，提取食品樣品中的病毒RNA或DNA，用于后續(xù)的PCR/RT-PCR分析，提取步驟通常包括細胞破碎、核酸結(jié)合、洗滌和洗脫等。如果目標病毒是RNA病毒，需要進行反轉(zhuǎn)錄（RT）步驟將RNA轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶（RT酶）和適當(dāng)?shù)囊镞M行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用適當(dāng)?shù)囊锖蚉CR/RT-PCR反應(yīng)體系，進行病毒核酸的擴增反應(yīng)。引物的選擇應(yīng)基于目標病毒的特定序列，反應(yīng)體系包括DNA/RNA模板、引物、酶（如聚合酶）、緩沖液和核酸擴增所需的核苷酸。

為了增加PCR/RT-PCR檢測的靈敏度，應(yīng)采用前處理步驟，包括預(yù)擴增或使用嵌合引物，以增加目標基因的拷貝數(shù)或縮小擴增目標的大小。擴增反應(yīng)完成后通過凝膠電泳或其他檢測方法分析PCR/RTPCR產(chǎn)物，凝膠電泳可用于檢測擴增產(chǎn)物的大小和質(zhì)量。此外，可以使用DNA探針或比色劑等方法進行陽性結(jié)果的特異性確認。通過與已知的陽性對照樣品進行比較，確認食品樣品中是否存在目標病毒；使用定量PCR/RT-PCR方法來確定目標病毒的數(shù)量，從而評估食品樣品中的病毒負載水平。

在PCR/RT-PCR檢測中，質(zhì)量控制至關(guān)重要，包括使用對照樣品進行檢測，以驗證試劑是否無污染，同時評估檢測過程中的假陽性結(jié)果。需要注意的是，不同病毒的檢測方法可能會有所不同，因此在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)目標病毒的特性和檢測要求進行相應(yīng)的優(yōu)化及調(diào)整。此外，PCR/RT-PCR方法需要特定的設(shè)備和實驗條件，并且對操作者的技術(shù)要求較高，需要在實驗室環(huán)境中進行。

4 結(jié)語

食品檢驗中微生物檢測技術(shù)的應(yīng)用研究對于確保食品安全至關(guān)重要。本文綜述了不同微生物檢測技術(shù)在食品檢驗中的應(yīng)用，重點介紹了實時定量PCR檢測食源性病原菌、GC-MS技術(shù)檢測食品中的腐敗菌和變質(zhì)標志物以及PCR/RT-PCR技術(shù)檢測食品中病毒和寄生蟲的原理、流程和優(yōu)勢。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進，微生物檢測技術(shù)在食品檢驗中的應(yīng)用將更加準確、快速和便捷。未來，期待更多新技術(shù)出現(xiàn)，以滿足食品安全監(jiān)管的需求。