周 琴，劉新月，李紹仙，張曉花，譚文涵

（普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南普洱 665000）

花生油含有豐富的不飽和脂肪酸，其中油酸能降低低密度脂蛋白膽固醇水平，而不會(huì)破壞高密度脂蛋白，有助于維持血脂平衡，預(yù)防心血管疾病[1]。此外，油酸還具有抗炎、預(yù)防肥胖、預(yù)防衰老、預(yù)防動(dòng)脈硬化和增強(qiáng)自身免疫力的功能[2-3]。然而，在對(duì)人體有益的同時(shí)，花生油也存在安全隱患。黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是造成花生油污染的主要原因之一[4]，在自然界中其主要以黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2存在，具有強(qiáng)毒性、致癌性、致畸性和致突變性，而黃曲霉毒素B1（AFB1）含量最高[5-6]。何景等[7]2019年在抽檢北京小包裝花生油時(shí)，黃曲霉毒素檢出率為26.67%。胡振等[8]在對(duì)2016—2017年廣西14個(gè)地級(jí)市抽檢食用植物油樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，花生油中黃曲霉毒素B1檢出率達(dá)到8.85%，花生油合格率僅為87.83%。真菌毒素是對(duì)人和動(dòng)物有嚴(yán)重慢性毒性的物質(zhì)[9]，如果大量攝入或長(zhǎng)期少量攝入黃曲霉毒素，可能會(huì)導(dǎo)致慢性中毒、增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究花生油中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法具有重要意義。

黃曲霉毒素檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[10]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[11]等，酶聯(lián)免疫吸附法簡(jiǎn)單、快速、特異性高，但假陽(yáng)性較多；高效液相色譜法具有良好的準(zhǔn)確性和高靈敏度，但需要衍生，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且較浪費(fèi)溶劑。液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）特異性強(qiáng)，定性定量準(zhǔn)確，檢出限低，從而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘、獸殘以及真菌毒素類的痕量檢測(cè)領(lǐng)域[12-15]。黃曲霉毒素的離子化狀態(tài)可利用電噴霧離子源實(shí)現(xiàn)，電噴霧離子源有正、負(fù)離子兩種模式，在正離子模式下效果最好[16]，因此，黃曲霉毒素離子化模式為ESI+。黃曲霉毒素凈化小柱包括兩個(gè)類型：多功能凈化柱與免疫親和柱。其中，多功能凈化柱采用復(fù)合材料，可以吸附蛋白質(zhì)、色素等[16]。盡管這種方法的凈化速度相對(duì)較快，但不能全面有效地消除干擾物質(zhì)。因此，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，多使用免疫親和柱來(lái)凈化樣品。本研究利用液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)花生油中黃曲霉毒素B1進(jìn)行定量分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（3200QTRAP，美國(guó)AB Scies）；色譜柱（phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A，100 mm×3.0 mm）；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司)；渦旋攪拌混勻器（英國(guó)Grant公司）；AL204電子天平（瑞士梅特勒）；IKA HS501振蕩器（德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司）；N-EVAP-24氮吹儀（美國(guó)Organomation公司)；微量可調(diào)移液槍（0.1～1.0 mL，德國(guó)Eppendorf公司）。

花生油，購(gòu)于沃爾瑪超市。黃曲霉毒素B1（100 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液（0.5 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó) Merck 公司）；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（普瑞邦公司）；質(zhì)控樣[MRM-AO，質(zhì)控值范圍為（12.44±1.38）μg·kg-1，普瑞邦]；甲酸（分析純，阿拉丁公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制

準(zhǔn)確移取1 mL濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10 mL，配制濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再準(zhǔn)確移取1 mL濃度為 10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇定容至10 mL，配制濃度為1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL和20 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液于1 mL進(jìn)樣瓶中，并同時(shí)加入40 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液，用初始流動(dòng)相定容至1 mL配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1、8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入20 μL濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品和200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液，加入20 mL乙腈-水溶液（80+20），渦旋混勻，置于振蕩器振蕩20 min，離心，取上清液備用。準(zhǔn)確移取4 mL上清液，加入46 mL 0.1%吐溫-20 PBS溶液混勻，將待凈化液轉(zhuǎn)移至50 mL注射器筒內(nèi)，以恒定流速流經(jīng)已活化的免疫親和柱，20 mL超純水淋洗免疫親和柱，真空泵抽干。2 mL甲醇洗脫黃曲霉毒素B1免疫親和柱，真空泵抽干全部親和柱，在水浴條件下將洗脫液濃縮至近干，初始流動(dòng)相定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，濾入樣品瓶上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl-100A色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm），進(jìn)樣量10.0 μL；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫35 ℃，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：離子化模式ESI+，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析參數(shù)

將體積濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1和內(nèi)標(biāo)單標(biāo)分別通過(guò)質(zhì)譜儀所配的外置進(jìn)樣泵進(jìn)樣，分別尋找其母離子和子離子并優(yōu)化碰撞電壓和去簇電壓。黃曲霉毒素B1及其內(nèi)標(biāo)在串聯(lián)質(zhì)譜上的檢測(cè)參數(shù)見表2，黃曲霉毒素B1及其內(nèi)標(biāo)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1及其內(nèi)標(biāo)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

表2 黃曲霉毒素B1及其內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS檢測(cè)參數(shù)

2.2 方法線性范圍和檢出限

在1.2.3儀器條件下，根據(jù)1.2.1配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、6 ng·mL-1、8 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1進(jìn)樣分析；工作曲線橫坐標(biāo)為目標(biāo)物質(zhì)量濃度C（ng·mL-1）；工作曲線縱坐標(biāo)為黃曲霉毒素B1峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比。圖2為黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線所擬合的線性方程。由圖2可知該檢測(cè)方法在1～20 ng·mL-1的質(zhì)量濃度內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3。

圖2 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在花生油空白基質(zhì)中分別加入3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，混勻1 min，使花生油空白基質(zhì)與所加入的標(biāo)準(zhǔn)品充分接觸后，加入200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液，按1.2.2中的方法充分提取和凈化后檢測(cè)。每個(gè)進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），以考察方法的準(zhǔn)確度和精確度，結(jié)果見表3。

表3 花生油中黃曲霉毒素B1的加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

由表3可知，在不同加標(biāo)水平下，黃曲霉毒素B1的回收率在94.1%～107.4%，相對(duì)偏差（RSD）為5.6%～9.3%，回收率滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）食品理化檢驗(yàn)中回收率要求即加標(biāo)量小于0.1 mg·kg-1時(shí)回收率為60%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。表明該方法的回收率和精密度滿足花生油中黃曲霉毒素B1殘留檢測(cè)的要求。

2.4 質(zhì)控樣測(cè)定

將所購(gòu)質(zhì)控樣采用該方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為13.12 μg·kg-1，質(zhì)控樣質(zhì)控值為（12.44±1.38）μg·kg-1，測(cè)定值在質(zhì)控值范圍內(nèi)，表明該方法對(duì)花生油中黃曲霉毒素B1陽(yáng)性樣品的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確性，適用于實(shí)驗(yàn)室中花生油中黃曲霉毒素B1的準(zhǔn)確定量分析。

3 結(jié)論

本研究建立了花生油中黃曲霉毒素B1的LCMS/MS測(cè)定方法，樣品前處理采用免疫親和柱技術(shù)，該方法無(wú)需進(jìn)行衍生，簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和精密度均滿足定量分析的要求。在1～20 ng·mL-1線性內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R2為0.999 3），在2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加標(biāo)水平下，回收率在94.1%～107.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為5.6%～9.3%，采用該方法測(cè)定花生油中黃曲霉毒素質(zhì)控樣，檢測(cè)結(jié)果在質(zhì)控樣質(zhì)控值范圍內(nèi)。因此，該方法可用于花生油中黃曲霉毒素B1的快速檢測(cè)。