邱敏霞,陳文妹,孔燦燦,毛葦

食管癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅國民健康。臨床上通過內(nèi)鏡聯(lián)合病理活檢進(jìn)行食管癌患者診斷,但單純內(nèi)鏡檢查敏感度低,而病理活檢時(shí)間長、具有有創(chuàng)性,給患者和臨床診療造成諸多不便[1]。多項(xiàng)研究表明,結(jié)合血清標(biāo)志物檢測(cè)對(duì)于食管癌早期診斷具有積極意義。本研究擬通過比較不同食管病變的放大內(nèi)鏡日本食管學(xué)會(huì)(Japanese Esophageal Society,JES)分型和血清血管生成相關(guān)分子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、CD34和CD105表達(dá),以內(nèi)鏡下活檢或手術(shù)的病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn),探討放大染色內(nèi)鏡聯(lián)合血管生成相關(guān)分子檢測(cè)在早期食管癌及癌前病變?cè)\斷中的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步將放大內(nèi)鏡檢測(cè)聯(lián)合血清標(biāo)志物構(gòu)建可視化列線圖,方便臨床實(shí)踐,以期為食管癌早篩早診提供新的方法,實(shí)現(xiàn)早期針對(duì)性干預(yù)治療,進(jìn)而提高相關(guān)患者的生活生命質(zhì)量,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2022年1月—2022年12月海南省人民醫(yī)院內(nèi)鏡診療中心檢出可疑早期食管癌或癌前病變患者152例,男89例,女63例,年齡36～79歲,中位年齡59歲。入組患者主要臨床癥狀為胸骨后不適、疼痛和吞咽哽噎感;44例患者既往診斷“慢性胃炎”“食管炎”和“反流性食管炎”等且接受過抑酸治療;53例患者有吸煙史或飲酒史;本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意[倫理號(hào)(2022)375號(hào)],患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①18歲以上;②常規(guī)內(nèi)鏡下見可疑病變,主要包括食管黏膜缺失、潰瘍、糜爛、表面粗糙、充血、隆起,黏膜缺失,或伴有黏膜血管紋理異常改變,可疑癌前病變或早癌的患者[2];③無合并其他器官來源腫瘤;④臨床病歷資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①既往診斷食管癌或同時(shí)伴有其他系統(tǒng)來源腫瘤;②胃腸道出血、凝血功能異?；蚪?周有阿司匹林、華法林等抗凝藥物服用史的患者;③妊娠或者哺乳期女性;④未接受病理活檢,或病理結(jié)果無法明確其良惡性。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 早期食管癌病變放大染色內(nèi)鏡及組織病理學(xué)檢查:術(shù)前禁食水8～10 h,檢查開始前20～30 min鹽酸達(dá)克羅寧膠漿[3]口服,祛除上消化道內(nèi)泡沫后表面麻醉,而后予丙泊酚(1.0～2.0 mg/kg)靜脈麻醉。首先,使用放大染色內(nèi)鏡白光模式觀察整個(gè)食管,記錄異常病變位置、大小、形態(tài)等;然后切換至窄帶光譜成像(NBI)模式,邊退鏡邊觀察食管黏膜、血管情況,仔細(xì)觀察并記錄食管可疑病變位置的黏膜變化和血管形態(tài);進(jìn)一步通過NBI聯(lián)合放大內(nèi)鏡,觀察病變部位的上皮乳頭內(nèi)毛細(xì)血管袢(IPCL)形態(tài),根據(jù)JES的AB分型系統(tǒng),記錄IPCL的形態(tài)[4]并評(píng)估病變性質(zhì);最后行盧戈碘染色并記錄不染區(qū)和淡染區(qū)的部位、大小、范圍等[5],并對(duì)病變部位進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3.2 血清VEGF、CD34和CD105表達(dá)水平檢測(cè):收集患者術(shù)前全血5 ml,離心留取上層血清,-80℃保存?zhèn)溆?。VEGF ELISA試劑盒購自碧云天公司,貨號(hào)為PV963;CD34和CD105 ELISA試劑盒購自上海滬震生物,貨號(hào)分別為HZ-CD34-Hu、HZ-ENG/CD105-Hu。從4℃冰箱中取出ELISA試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品(重組蛋白或者單價(jià)的小分子,用于定量分析)離心,利用倍比稀釋法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)說明進(jìn)行檢測(cè),采用1∶100比例對(duì)生物素標(biāo)記抗體和辣根過氧化物酶親和素進(jìn)行稀釋,并置于室溫備用[6]。每孔加生物素標(biāo)記抗體100 μl,37℃溫育1 h,棄去孔內(nèi)液體、甩干、洗板;每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μl,室溫放置1 h,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板;依序每孔加底物溶液90 μl,37℃避光顯色15～30 min,使用酶標(biāo)儀(Multiskan FC,賽默飛)在450 nm波長依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)[6],計(jì)算VEGF、CD34和CD105表達(dá)水平。

1.3.3 組織活檢及病理標(biāo)準(zhǔn):內(nèi)鏡下留取活檢組織及內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(ESD) 切除標(biāo)本,首先經(jīng)過10%甲醛固定,并于24 h內(nèi)病理科送檢。病理結(jié)果的診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行“維也納分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)”[4]。根據(jù)組織病理學(xué)檢查將食管病變分為炎性反應(yīng)、輕度不典型增生、重度不典型增生和食管早癌;其中重度不典型增生屬于高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變,輕—中度不典型增生屬于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。

2 結(jié) 果

2.1 早期食管癌病變的放大染色內(nèi)鏡及組織病理學(xué)檢查 患者均經(jīng)內(nèi)鏡下活檢或術(shù)后病理明確診斷,其中炎性反應(yīng)34例,輕度不典型增生27例,重度不典型增生28例,早期食管癌63例。放大內(nèi)鏡觀察病變部位的IPCL形態(tài)JES-AB分型,其典型形態(tài)見圖1。放大內(nèi)鏡下JES分型:A型80例(早癌11例);B1型51例(早癌36例);B2型14例(早癌10例);B3型7例(早癌6例),見表1。組織病理診斷是食管早癌的金標(biāo)準(zhǔn),本研究中利用放大內(nèi)鏡觀察JES-AB分型診斷食管早癌的敏感度為0.730、特異度為0.663。

注:A.A型,IPCL輕度擴(kuò)張,多見于食管炎性反應(yīng);B.B1型,IPCL擴(kuò)張和延長,多見于輕—中度不典型增生;C.B2型,IPCL擴(kuò)張和蛇形,多見于重度不典型增生;D.B3型,IPCL擴(kuò)張、扭曲和不規(guī)則變形,多見于早癌。圖1 放大內(nèi)鏡檢查對(duì)食管毛細(xì)血管袢進(jìn)行JES分型(盧戈碘染色,×80)Fig.1 JES typing of esophageal capillary loops by magnifying endoscopy (Lugo iodine staining, × 80)

表1 不同JES分型中早癌與非癌(炎性反應(yīng)和輕/重度不典型增生)所占比例 [例(%)]Tab.1 Proportion of early cancer and non cancer (inflammatory response and mild/severe atypical hyperplasia) in different JES subtypes

2.2 不同食管病變患者血清VEGF、CD34和CD105等標(biāo)志物水平比較 血清VEGF、CD34和CD105在炎性反應(yīng)、輕度不典型增生、重度不典型增生及食管早癌的患者中水平依次升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

表2 不同食管病變患者血清VEGF、CD34和CD105水平比較Tab.2 Comparison of Serum VEGF, CD34, and CD105 Levels in Patients with Different Esophageal Lesions

2.3 放大內(nèi)鏡檢查聯(lián)合血清標(biāo)志物診斷早期食管癌列線圖模型構(gòu)建 為便于臨床實(shí)踐,筆者構(gòu)建了基于放大內(nèi)鏡JES分型聯(lián)合血清標(biāo)志物VEGF、CD34和CD105的食管早癌診斷模型。該模型納入的指標(biāo)包括性別、年齡、JES分型、血清VEGF、CD34和CD105水平,通過列線圖可方便查找各指標(biāo)對(duì)應(yīng)的單指標(biāo)評(píng)分,進(jìn)一步將各單指標(biāo)評(píng)分相加得到總評(píng)分,進(jìn)而找到其對(duì)應(yīng)食管早癌可能性,見圖2,若食管病變患者的列線圖總評(píng)分>400分,則該患者為食管癌的可能性超過90%;若總評(píng)分<150分,則其患食管癌的可能性僅為10%。

圖2 放大內(nèi)鏡檢查聯(lián)合血清標(biāo)志物診斷食管早癌列線圖模型構(gòu)建Fig.2 Construction of a nomogram model for the diagnosis of early esophageal cancer using magnifying endoscopy combined with serum markers

2.4 列線圖模型和各血清標(biāo)志物診斷食管早癌價(jià)值分析 繪制列線圖模型和血清VEGF、CD34、CD105診斷食管早癌價(jià)值的ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,列線圖模型和血清VEGF、CD34、CD105診斷食管早癌的AUC分別為0.922、0.821、0.772和0.687,列線圖模型診斷食管早癌價(jià)值較大,見表3、圖3。

圖3 列線圖模型和各血清標(biāo)志物診斷食管早癌的ROC曲線Fig.3 Receiver operating characteristic of nomogram model and serum markers in diagnosis of early esophageal cancer

表3 列線圖模型和各血清標(biāo)志物診斷食管早癌的價(jià)值比較Tab.3 Comparison of the diagnostic value of the column chart model and various serum markers for early esophageal cancer

3 討 論

食管癌是全球腫瘤發(fā)病率第8位,病死率第6位的惡性腫瘤[7]。我國是食管癌高發(fā)國家,尤其在農(nóng)村高發(fā),食管癌仍是嚴(yán)重威脅居民生活質(zhì)量的疾病。食管癌患者具有早期癥狀隱匿、易漏診、中晚期治療困難、預(yù)后差的特點(diǎn)[8-9]。因此,對(duì)食管癌高危人群篩查和早期診斷和治療干預(yù)對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。本研究通過比較不同食管病變的放大內(nèi)鏡JES分型和血清血管生成相關(guān)分子(VEGF、CD34和CD105)表達(dá),探討放大染色內(nèi)鏡聯(lián)合血管生成相關(guān)分子檢測(cè)在早期食管癌及癌前病變?cè)\斷中的應(yīng)用價(jià)值。

隨著內(nèi)鏡檢查發(fā)展,內(nèi)鏡對(duì)早期食管癌的診斷具有重要價(jià)值。其中放大內(nèi)鏡檢查增加了黏膜上皮、黏膜凹窩以及黏膜下血管的對(duì)比度和清晰度,可以更清楚地觀察食管黏膜的細(xì)微結(jié)構(gòu),在早期食管癌診斷中的價(jià)值日益突出。研究顯示,普通內(nèi)鏡診斷食管早癌的準(zhǔn)確度約為60%,放大內(nèi)鏡診斷食管早癌的敏感度為70%～90%[10-11],受限于醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)水平和樣本量不同而略有差異。本研究中單純放大內(nèi)鏡檢查評(píng)估食管早癌的敏感度為0.830,特異度為0.763,與既往研究一致。

VEGF又稱血管通透因子,具有增加血管通透性、細(xì)胞外基質(zhì)變性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和促進(jìn)新生血管形成的作用,在炎性反應(yīng)、損傷修復(fù)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)節(jié)作用[12-13]。VEGF可促進(jìn)腫瘤新生血管生成,促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移,其水平升高與患者預(yù)后差顯著相關(guān)[14-16]。通過使用貝伐珠單抗等抗血管生成藥物,可抑制機(jī)體VEGF水平,抑制腫瘤新生血管生成,在包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤中均具有顯著抑制作用[17-18]。本研究中食管早癌患者血清VEGF水平顯著高于食管炎性反應(yīng)以及輕重度不典型增生患者,同樣提示VEGF可能與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

CD34是一種高度糖基化的細(xì)胞表面抗原,在成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞上廣泛表達(dá),可促進(jìn)炎性細(xì)胞的運(yùn)輸,介導(dǎo)白細(xì)胞聚集并穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞向炎性反應(yīng)部位移行,啟動(dòng)炎性反應(yīng),并協(xié)同趨化因子增強(qiáng)炎性反應(yīng)[19-20]。此外,CD34參與細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別和增殖遷移,是創(chuàng)傷愈合、凝血、炎性反應(yīng)及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生理病理過程的分子基礎(chǔ)[21]。CD105是透明帶蛋白家族的跨膜糖蛋白,在炎性反應(yīng)、傷口愈合及腫瘤等血管生成增加的組織中表達(dá)顯著增加[22-23]。本研究食管早癌患者血清CD34、CD105水平均顯著高于非癌患者,提示CD34和CD105與食管癌發(fā)生發(fā)展?jié)撛谙嚓P(guān),且可用于食管癌輔助診斷,但是診斷準(zhǔn)確度與放大內(nèi)鏡JES分型相當(dāng),略低于血清VEGF水平。

為進(jìn)一步提高食管早癌診斷準(zhǔn)確性,本研究進(jìn)一步將放大內(nèi)鏡檢測(cè)聯(lián)合血清標(biāo)志物構(gòu)建可視化列線圖,該列線圖模型具有最高的診斷準(zhǔn)確性,高于放大內(nèi)鏡JES分型和VEGF、CD34和CD105等血清標(biāo)志物。該模型納入指標(biāo)易于臨床獲取,便于臨床實(shí)踐,有望提高食管癌早篩早診準(zhǔn)確性,實(shí)現(xiàn)早期針對(duì)性干預(yù)治療,進(jìn)而提高相關(guān)患者的生活生命質(zhì)量。盡管本研究綜合分析放大內(nèi)鏡聯(lián)合血管生成相關(guān)分子標(biāo)志物在食管早癌中的診斷價(jià)值,建立了更為準(zhǔn)確的列線圖模型。但本研究的血清學(xué)指標(biāo)僅為內(nèi)鏡檢查前的單次血樣結(jié)果,缺少對(duì)患者長時(shí)間的動(dòng)態(tài)評(píng)估。此外,本研究為單中心數(shù)據(jù),樣本量尚需要進(jìn)一步補(bǔ)充,該模型尚需要其他中心的獨(dú)立數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,以增加其臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

邱敏霞:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文撰寫、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;陳文妹、孔燦燦:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;毛葦:提出研究思路,論文審核