余鳳,李良,李鴻雁,楚鑫

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)主要起源于肺部腺體或支氣管黏膜[1],其早期無明顯癥狀,隨病情進(jìn)展可表現(xiàn)為咳嗽等臨床癥狀,同時(shí)常因腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而出現(xiàn)一系列并發(fā)癥,此時(shí)患者可能錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī),預(yù)后相對較差[2]。因此,尋找能早期評估NSCLC患者預(yù)后的指標(biāo),對NSCLC的治療及改善患者近遠(yuǎn)期預(yù)后是非常重要的。既往研究發(fā)現(xiàn)[3-4],微小RNA(microRNA,miRNA)可通過與靶基因信使RNA(mRNA)3’端非翻譯區(qū)結(jié)合在NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過程中起關(guān)鍵性作用。微小RNA-605-5p(microRNA-605-5p,miR-605-5p)是miRNA中一員,其異常表達(dá)與NSCLC發(fā)病有關(guān)[5]。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor alpha induced protein 3,TNFAIP3)是內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)腫瘤壞死因子誘導(dǎo)后表達(dá)的編碼產(chǎn)物,可參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞分化等過程,在多種腫瘤的惡變過程中發(fā)揮重要作用[6]。研究證實(shí),miR-605-5p可通過靶向TNFAIP3促進(jìn)NSCLC發(fā)展[7]。但二者的靶向作用尚未在臨床研究中得到證實(shí)。因此,現(xiàn)分析NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3表達(dá)水平及其對患者預(yù)后的潛在評估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月—2018年1月在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)行手術(shù)切除的NSCLC患者87例作為觀察對象。術(shù)中留取NSCLC組織及距其>3 cm的癌旁正常組織,并置于液氮中保存。男47例,女40例;年齡38～75(54.19±14.82)歲,≤54歲43例,>54歲44例;吸煙52例,無吸煙35例;腫瘤直徑:≤3 cm 46例,>3 cm 41例;組織類型:腺癌38例,鱗癌49例;TNM分期[8]:Ⅰ期19例,Ⅱ期36例,Ⅲ期32例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(ZDLS-臨床2014-04),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)病理證實(shí)[6];②臨床病理資料完整;③均為首次確診患者且配合隨訪。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤;②入組前接受抗腫瘤治療;③嚴(yán)重肝、腎功能障礙者;④合并其他肺部疾病。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測TNFAIP3表達(dá):NSCLC組織和癌旁正常組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后,加入稀釋的兔抗人TNFAIP3單克隆抗體(批號KL-18641,購自上海魯汶生物科技有限公司)工作液,濃度為1∶100,其余檢測方法參照即用型高效免疫組織化學(xué)二抗試劑盒(批號YS09322B,購自上海雅吉生物科技有限公司)說明書操作,其中陽性對照和陰性對照分別為已知陽性切片、磷酸鹽緩沖液。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師共同對每張切片的染色結(jié)果進(jìn)行判讀,(1)細(xì)胞染色強(qiáng)度評分:無顯色、弱顯色、中等顯色、強(qiáng)顯色分別為0、1、2、3分;(2)陽性染色的細(xì)胞比例:<5%、5%～20%、21%～50%、51%～75%、>75%分別為0、1、2、3、4分。以兩項(xiàng)評分的乘積<4分為TNFAIP3陰性,乘積≥4分為TNFAIP3陽性[9]。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá):取出液氮中保存的NSCLC和癌旁正常組織標(biāo)本,采用Trizol試劑盒(批號HK-6013M,購自美國Invitrogen公司)提取總RNA,并依照TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號931047,購自杭州市?；锟萍加邢薰?說明書中的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA并置于-80℃冰箱保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 47 s、56℃ 19 s,共運(yùn)行45個(gè)循環(huán)。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,見表1。反應(yīng)完成后,用2-△△Ct法分析并計(jì)算miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA引物序列Tab.1 miR-605-5p, TNFAIP3 mRNA primer sequences

1.3.3 預(yù)后隨訪:NSCLC患者術(shù)后第1天開始隨訪,隨訪至2023年1月31日,共隨訪5年。隨訪方式為打電話或門診復(fù)查,隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束。無失訪患者,計(jì)算總生存率。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC組織和癌旁正常組織中TNFAIP3表達(dá)比較 TNFAIP3主要表達(dá)于細(xì)胞漿,呈棕黃色或棕褐色顆粒,見圖1。NSCLC組織中TNFAIP3陽性率為25.29%(22/87),明顯低于癌旁正常組織的57.47%(50/87),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=18.575/<0.001)。

注:紅色箭頭指示為TNFAIP3表達(dá)圖1 NSCLC組織中TNFAIP3表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)Fig.1 TNFAIP3 expression in NSCLC tissue (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 NSCLC組織和癌旁正常組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平比較 NSCLC組織中miR-605-5p表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01),TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.01),見表2。

表2 NSCLC組織和癌旁正常組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissue and normal tissue adjacent to cancer

2.3 miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)在不同臨床/病理特征中差異比較 分別以NSCLC組織miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平均值1.86、0.51為界,將患者分為miR-605-5p低表達(dá)組42例(miR-605-5p<1.86)和miR-605-5p高表達(dá)組45例(miR-605-5p≥1.86),TNFAIP3 mRNA低表達(dá)組41例(TNFAIP3 mRNA<0.51)和TNFAIP3 mRNA高表達(dá)組46例(TNFAIP3 mRNA≥0.51);NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)與性別、年齡、吸煙、腫瘤直徑、組織類型無關(guān)(P>0.05);miR-605-5p高表達(dá)組TNM分期中Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例明顯高于miR-605-5p低表達(dá)組(P<0.01);TNFAIP3 mRNA低表達(dá)組TNM分期中Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例明顯高于TNFAIP3 mRNA高表達(dá)組(P<0.01),見表3。

表3 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA在不同臨床/病理特征中表達(dá)差異比較 [例(%)]Tab.3 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression differences in different clinical/pathological features in NSCLC tissues

2.4 NSCLC組織中miR-605-5p與TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 NSCLC組織中miR-605-5p與TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.453,P<0.001)。

2.5 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)與患者生存的關(guān)系 NSCLC患者隨訪5年,生存34例(生存組),死亡53例(死亡組);miR-605-5p低表達(dá)組5年總生存率為52.38%(22/42),明顯高于miR-605-5p高表達(dá)組的26.67%(12/45),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.034,P=0.014);TNFAIP3 mRNA低表達(dá)組5年總生存率為21.95%(9/41),明顯低于TNFAIP3 mRNA高表達(dá)組的54.35%(25/46),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.557,P=0.002)。

2.6 生存組和死亡組NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平比較 死亡組NSCLC組織中miR-605-5p表達(dá)水平明顯高于生存組(P<0.05),TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平明顯低于生存組(P<0.01),見表4。

表4 生存組和死亡組NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平比較Tab.4 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissues between survival and death groups

2.7 影響NSCLC患者5年內(nèi)生存的多因素分析 以NSCLC患者5年內(nèi)生存情況為因變量(生存=0,死亡=1),以TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ期=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0,有=1)、miR-605-5p(低表達(dá)=0,高表達(dá)=1)、TNFAIP3 mRNA(高表達(dá)=0,低表達(dá)=1)為自變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TNM Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-605-5p高表達(dá)、TNFAIP3 mRNA低表達(dá)是影響NSCLC患者5年內(nèi)生存的危險(xiǎn)因素(P<0.01),見表5。

表5 影響NSCLC患者5年內(nèi)生存的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis on the 5-year survival of NSCLC patients

2.8 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平對患者5年內(nèi)生存的預(yù)測價(jià)值 繪制NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA及二者聯(lián)合預(yù)測患者5年內(nèi)生存的ROC曲線,并計(jì)算AUC,結(jié)果顯示:miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA及二者聯(lián)合預(yù)測患者5年內(nèi)生存的AUC分別為0.761、0.837、0.910;二者聯(lián)合的AUC高于miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA各自單獨(dú)預(yù)測的AUC(Z=2.716、1.986,P=0.007、0.047),見圖2、表6。

圖2 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA預(yù)測患者5年內(nèi)生存的ROC曲線Fig.2 Receiver operating characteristic of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA in NSCLC tissue predicting patients' survival within 5 years

表6 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平對患者5年內(nèi)生存的預(yù)測價(jià)值Tab.6 Predictive value of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissue for 5-year survival of patients

3 討 論

miRNA是一類具有廣泛生物學(xué)功能的非編碼RNA,近年來研究顯示其在肺癌發(fā)生發(fā)展及放化療耐藥性中均扮演著重要角色,可通過對miRNA的調(diào)控為肺癌的治療提供新方向[10-11]。相關(guān)研究表明,miR-139-5p、miR-25-3p等在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)存在差異[12-14]。Ye等[15]研究發(fā)現(xiàn),miR-605高表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。但NSCLC和癌旁組織中miR-605-5p的表達(dá)是否存在差異尚不十分清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NSCLC組織中miR-605-5p表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,與Ye等[15]研究結(jié)果類似,提示miR-605-5p表達(dá)上調(diào)可能與NSCLC發(fā)病有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-605-5p高表達(dá)者TNM分期Ⅲ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例較高,提示miR-605-5p表達(dá)變化與NSCLC惡變程度有關(guān),可能原因是miR-605-5p高表達(dá)的NSCLC組織中癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,可加速NSCLC進(jìn)展。本研究繪制以miR-605-5p表達(dá)水平均值為界值的Kaplan-Meier生存曲線,結(jié)果顯示與miR-605-5p高表達(dá)者比較,miR-605-5p低表達(dá)者具有較高的5年總生存率,提示檢測miR-605-5p表達(dá)可能有利于評估NSCLC患者遠(yuǎn)期生存情況。此外,死亡患者的NSCLC組織中miR-605-5p表達(dá)水平較生存患者高,miR-605-5p高表達(dá)是影響NSCLC患者5年內(nèi)生存的危險(xiǎn)因素,且其可作為預(yù)測患者5年內(nèi)生存的指標(biāo),提示miR-605-5p可能作為評估NSCLC患者生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

TNFAIP3又稱為鋅指蛋白A20,含7個(gè)鋅指區(qū)的C和N末端區(qū),首次發(fā)現(xiàn)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[16-17]。TNFAIP3作為一種核因子-κB信號通路抑制劑,其在炎性反應(yīng)相關(guān)的多種惡性疾病中有重要意義[18-19]。Sharif-Askari等[20]研究報(bào)道,乳腺癌組織中TNFAIP3呈低表達(dá),且會影響乳腺癌患者預(yù)后。秦英[21]研究發(fā)現(xiàn),彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤病灶內(nèi)TNFAIP3 mRNA表達(dá)量較對照組低,其低表達(dá)與患者淋巴瘤分期有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),NSCLC組織中TNFAIP3陽性率、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平均較癌旁正常組織低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)TNFAIP3低表達(dá)者TNM分期Ⅲ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例較高,提示TNFAIP3表達(dá)下調(diào)可能參與NSCLC發(fā)生、發(fā)展,與Sharif-Askari等[20]和秦英[21]的研究結(jié)果相似,可能原因是TNFAIP3作為癌癥抑制因子,其低表達(dá)會使NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為增強(qiáng),從而加快NSCLC惡性進(jìn)展。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示,TNFAIP3高表達(dá)者5年總生存率明顯高于TNFAIP3低表達(dá)者,提示TNFAIP3表達(dá)可能與NSCLC患者不良預(yù)后有一定關(guān)聯(lián)。同時(shí)死亡患者的NSCLC組織中TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平明顯低于生存患者,TNFAIP3 mRNA低表達(dá)是影響NSCLC患者5年內(nèi)生存的危險(xiǎn)因素,且其預(yù)測患者5年內(nèi)生存的AUC為0.837,進(jìn)一步提示檢測TNFAIP3表達(dá)對判斷NSCLC患者預(yù)后有一定價(jià)值。ROC曲線結(jié)果還顯示,miR-605-5p聯(lián)合TNFAIP3 mRNA預(yù)測患者5年內(nèi)生存的AUC高于二者單獨(dú)預(yù)測的AUC,提示聯(lián)合檢測miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達(dá)水平,可能對判斷患者5年內(nèi)生存情況更有意義。此外,Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),NSCLC組織中miR-605-5p與TNFAIP3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示miR-605-5p和TNFAIP3 mRNA可能相互影響,在NSCLC患者預(yù)后中發(fā)揮作用,但具體作用機(jī)制需深入探討。

綜上所述,miR-605-5p在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào),TNFAIP3 mRNA表達(dá)下調(diào),二者呈負(fù)相關(guān),與NSCLC患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),均可能作為評估患者預(yù)后的重要指標(biāo),可為NSCLC的靶向治療提供新思路。但臨床影響NSCLC患者預(yù)后的因素較多,為驗(yàn)證結(jié)果需擴(kuò)大樣本繼續(xù)探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

余鳳:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,撰寫論文;李良:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;李鴻雁:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;楚鑫:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析