鄭偉濤 胡康洪*

(湖北工業(yè)大學1.中德生物醫(yī)學中心;2.工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心;3.國家外專局/教育部細胞調(diào)控與分子藥物“111”引智基地,武漢 430068)

引 言

近年來,疾病的多發(fā)使得臨床導尿管的使用量逐漸增多,留置導管是醫(yī)院為患者解決不能自主排尿的主要方案,然而,長期留置導管會導致細菌感染[1]。導管相關(guān)性尿路感染(catheter-associated urinary tract infection,CAUTI)是由長期在患者體內(nèi)留置導管造成的,是醫(yī)院常見的細菌感染之一,可引起許多醫(yī)療并發(fā)癥,例如導管結(jié)痂、膀胱結(jié)石、敗血癥、內(nèi)毒素休克和腎盂腎炎[2-3]。因此,如何減少和預防CAUTI 的發(fā)生是臨床上亟待解決的問題。造成CAUTI 的主要原因為細菌易在導管表面黏附并形成難以清除的生物膜,該過程涉及的主要細菌包括大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等[4-5]。面對臨床的迫切需求,開發(fā)具有抗菌效果的導尿管成為科研工作者及醫(yī)療保健企業(yè)等共同關(guān)注的重點。目前,臨床上應(yīng)對CAUTI 的主要策略是對導管材料表面進行物理及化學方面的修飾改性(如涂敷抗菌涂層),使其可以將殺菌劑釋放到環(huán)境中,從而起到持續(xù)的抗菌及殺菌效果,這是預防生物膜形成的有效手段之一[6-9]。

近年來,一氧化氮(NO)作為抗菌劑在生物抗菌領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。NO 是一種內(nèi)皮源性舒張因子,研究發(fā)現(xiàn),其反應(yīng)副產(chǎn)物如N2O3和ONOO-(過氧亞硝酸鹽)可通過氧化和亞硝基化應(yīng)激,對微生物蛋白質(zhì)、DNA、代謝酶和外膜結(jié)構(gòu)造成氧化和亞硝基化損傷,從而改變重要的蛋白質(zhì)功能并誘導細菌細胞死亡,從而根除細菌[10-11]。NO 作為殺菌劑已被證明可以對抗廣泛的革蘭氏陰性菌(如銅綠假單胞菌和大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌),以及耐藥細菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))[12-13]。已有研究證明NO 釋放可以有效防止細菌黏附[14],采用模擬內(nèi)源性NO 釋放的聚合物材料抗菌提供了一種潛在的解決醫(yī)療器械相關(guān)感染的方法。S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)是一種成本低、安全性高的S-亞硝基硫醇(RSNO)類NO 供體,可以分解并釋放NO,其中RSNO 是一類新興的內(nèi)源性和外源性NO 供體。當SNAP 摻入吸水率非常低的聚合物時,可長期持續(xù)釋放NO。Wo 等[15]制備了一種SNAP 摻雜的CarboSil 聚合物導管,在生理通量水平上該導管可持續(xù)釋放NO超過3 周,實驗結(jié)果表明其可以顯著降低細菌的生存能力。然而,目前關(guān)于SNAP 導尿管抗菌性能的研究仍缺乏在大動物模型上的進一步評價。因此,本文制備了可持續(xù)釋放NO 的SNAP 導尿管,評價了其在體外及綿羊體內(nèi)的抗菌性能,以期為SNAP 導尿管的臨床應(yīng)用提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 實驗材料

一次性使用無菌硅膠導尿管,廣州維力醫(yī)療器械股份有限公司;納米銀抗菌導尿管,美昕醫(yī)療器械(上海)有限公司;金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸 埃 希 菌 ( ATCC8739 )、銅 綠 假 單 胞 菌(ATCC9027)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC10031),武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心;胰酪胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;血管鞘(402-606X),北京迪瑪克醫(yī)藥科技有限公司;泌尿道引導絲(1001780-HC),張家港市華美醫(yī)療器械有限公司;一次性使用球囊壓力泵(SM-IDA2530H-TB),深圳市昕力醫(yī)療設(shè)備開發(fā)有限公司;Y 型閥(DMK-Y)、三通(409511CN)、指引導管(LA6JR40)、丙泊酚,四川國瑞藥業(yè)有限責任公司;舒泰,北京佑寵生物科技有限公司;異氟烷,友誠生物科技有限公司;0.9%生理鹽水,河南科倫藥業(yè)有限公司;肝素鈉注射液,齊魯制藥有限公司;注射用青霉素鈉,瑞陽制藥有限公司;非吸收性外科縫線,揚州環(huán)宇醫(yī)療器械有限公司;N-乙酰-D-青霉胺(Nacetyl-D-penicillamine,NAP)、亞硝酸鈉(NaNO2),Sigma-Aldrich 公司;PBS 緩沖液(pH7.2 ～7.4),Gibco 公司;鹽酸(HCl)、丙酮、乙醚、四氫呋喃(THF),均為分析純,國藥集團化學試劑北京有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA),純度≥99.5%,北京索萊寶科技有限公司。

雌性綿羊,30 ～40 kg,來源于濃濃(北京)生物科技有限公司。常溫飼養(yǎng),每籠一只,普通飼料喂養(yǎng),每只每天供給其體重5%的飼料,自由攝食,自由飲水,每天沖洗清潔羊籠,直至實驗結(jié)束。實驗動物福利與倫理審查預先經(jīng)湖北工業(yè)大學中德生物醫(yī)學中心生命科學研究倫理審查委員會批準。

1.1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計(UV-Vis)(UV-752),Shimadzu 公司;一氧化氮分析儀(Nitric Oxide Analyzer)(NOA 280i),美國通用電氣集團分析儀器公司;恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-1102C),上海智誠分析儀器制造有限公司;離心機(Sorvall Legend Micro 17),Thermo Scientific 公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱(DNP -9082),上海精宏實驗設(shè)備有限公司;呼吸麻醉機(ACM608),北京航天長峰公司;呼吸機(SV350)、除顫儀(BeneHert D6),深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 SNAP 的合成

按照文獻[16]的方法合成SNAP。稱取0.478 g NAP 溶解于8.0 mL 水(含有2.5 mL 的1.0 mol/L HCl)中,加入0.173 g NaNO2,在5 ℃下攪拌40 min后,用5 mL 丙酮處理該溶液并繼續(xù)攪拌10 min。抽濾除去綠色沉淀物,用冰水洗滌5 次,用10 mL 丙酮和乙醚的混合溶劑洗滌3 次,得到產(chǎn)物SNAP,置于真空干燥箱中干燥。使用紫外可見分光光度計在200 ～700 nm 的范圍內(nèi)記錄UV-Vis 光譜。

1.3 SNAP 導尿管的制備

參照文獻[17]的方法制備SNAP 導管。將SNAP 溶解在THF 中15 min(SNAP 的質(zhì)量濃度為125 mg/mL),然后將一次性使用無菌硅膠導管在黑暗中完全浸入含有SNAP 的THF 溶液中2 h。在該溶脹/浸漬期之后,在通風櫥中將導管在黑暗環(huán)境下干燥72 h 以去除殘留溶劑,得到SNAP 導尿管。

1.4 NO 釋放量測定

將SNAP 導管剪成長度為1 cm 的小段,將導管段放置在琥珀色玻璃瓶中,瓶內(nèi)裝有4 mL PBS 緩沖液(pH 7.4)和100 μmol/L EDTA(浸入37 ℃水浴中),使用一氧化氮分析儀測定SNAP 導管的NO 釋放量。NO 持續(xù)產(chǎn)生后,立即被N2掃氣和鼓泡器凈化并掃入化學發(fā)光檢測室。在測定NO 釋放量期間,將所有導管置于新鮮的PBS 緩沖液中,并且在每次測量后在沒有環(huán)境光的條件下于37 ℃孵育。

1.5 體外抗菌性能評價

1.5.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌加入TSB 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),在(37 ±2)℃的條件下培養(yǎng)至其菌液的OD600(600 nm波長下的吸光度值)為0.45 左右,此時菌液濃度通常為106～107cfu/mL,各試驗菌種的濃度如表1所示。

表1 受試菌種的濃度Table 1 Concentrations of the tested bacteria

1.5.2 導尿管預處理

將制備的SNAP 導尿管剪成長度為1 cm 的小段,陰性對照樣品(一次性無菌硅膠導尿管)與陽性對照樣品(納米銀抗菌導尿管)均制成與受試樣品等長的小段。

1.5.3 試驗菌接種

將200 mL TSA 培養(yǎng)基(融化后用水浴冷卻至45 ℃左右)與20 mL 新鮮培養(yǎng)的菌液充分混合,然后倒在平板上,在培養(yǎng)基未凝固時用無菌鑷子將長度為1 cm 的導尿管分別垂直插入和平行放置于TSA 平板培養(yǎng)基中。每個平板放置1 個SNAP 導尿管、1 個納米銀抗菌導尿管和1 個一次性無菌硅膠導尿管,每兩個樣品之間距離25 mm 以上,樣品與平板邊緣距離15 mm 以上,然后蓋上培養(yǎng)皿等待凝固。

1.5.4 培養(yǎng)與觀察

待培養(yǎng)基凝固后,將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 ～18 h,取出觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生,并選取均勻的抑菌圈測量其直徑。

1.6 體內(nèi)抗菌性能評價

1.6.1 實驗分組

將24 只綿羊平均分成4 組,每組6 只。其中1組為正常飼養(yǎng)對照組,另外3 組為實驗組:SNAP 導尿管組、納米銀抗菌導尿管組、一次性硅膠導尿管組。

1.6.2 綿羊?qū)蚬芰糁媚Ｐ偷臉?gòu)建

參照文獻[18]的方法構(gòu)建綿羊?qū)蚬芰糁媚Ｐ?。將綿羊麻醉后,用碘伏對綿羊的尿道周圍進行消毒,確保導管插入時周圍環(huán)境處于無菌狀態(tài)。按住綿羊,使其仰臥位導尿,打開導尿包,用鑷子夾住碘伏棉球?qū)d羊尿道口處進行常規(guī)消毒后鋪巾,用無菌水劑潤滑導尿管,并保持導尿管夾處于松開狀態(tài)。用鑷子持導尿管輕輕插入尿道,插入的深度為距離尿道口2 ～5 cm,見有尿液流出后再插入2 cm,導尿管外端開口置于接尿盒中。固定住止回閥外壁,用不帶針頭的注射器經(jīng)閥門注入額定的無菌水,使膨脹的球囊卡在膀胱出口。固定閥門外壁,緩慢拔下注射器,止回閥閥門自動密封,保持球囊膨脹。留取中段尿,置于無菌試管中送檢,用于細菌培養(yǎng)。連接引流袋和導尿管,如不需要持續(xù)導尿,則夾閉導尿管夾。用無菌縫合線將引流袋和導尿管固定到綿羊尾部,并對縫合線部位消毒。手術(shù)后,固定住導管止回閥,用不帶針頭的空注射器插入止回閥內(nèi),抽吸球囊中的水,當抽出水與注入水的體積接近時緩慢拔出導尿管。如需留置導尿管,則用膠布將其固定。

1.6.3 尿液含菌量檢測

每日觀察實驗動物的精神狀態(tài)、行為活動和攝食等情況,分別在第1、3、7、17 天(一般硅膠對照組最長15 天)收集綿羊尿液中段2 管,送往醫(yī)院進行尿常規(guī)檢測和尿液細菌學檢查。采用培養(yǎng)菌落計數(shù)的方法測定尿液含菌量:取200 mL TSA 培養(yǎng)基倒在平板上待其完全凝固,然后將收集的尿液標本輕輕混勻,用定量接種環(huán)分別取尿液1 μL 涂抹接種于平板上,倒置,于35 ～37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h,觀察細菌的菌落生長情況并進行計數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 SNAP 的UV-Vis 測試結(jié)果

對合成的SNAP 進行紫外可見分光光度檢測,結(jié)果如圖1 所示。在339 nm 波長處SNAP 有最大吸光度,符合SNAP 的特征吸收峰,表明合成的SNAP 成功引入了亞硝基硫醇結(jié)構(gòu)。

圖1 SNAP 的UV-Vis 譜圖Fig.1 UV-Vis spectrum of SNAP

2.2 SNAP 導管的NO 釋放量

圖2 為SNAP 導管的典型NO 釋放曲線,可以看出,在約600 s 時即觀察到NO 的釋放,釋放量約為0.3 ×10-10mol/(min·cm2),此后NO 釋放量緩慢增加。圖3 為SNAP 導管在20 天中的NO 長期釋放曲線,在第1 天觀察到NO 的釋放量最大,約為1.8 ×10-10mol/(min·cm2),這 主 要 歸 因 于SNAP在導管表面的分布,即SNAP 從導管表面的最外層快速浸出到緩沖液中。當最外層區(qū)域的SNAP 耗盡后,在第2 天NO 釋放量開始下降(約為0.5 ×10-10mol/(min·cm2)),然后在接下來的18 天內(nèi)NO釋放量逐漸下降到0.1×10-10mol/(min·cm2)。導管中涂層的大部分SNAP 分子是以結(jié)晶形式存在的,嵌入聚合物主體中的結(jié)晶SNAP 需要一定時間溶解和釋放NO,因此認為這種緩慢的晶體溶解過程是SNAP 導管能夠長期釋放NO 的原因。

圖2 SNAP 導管的典型NO 釋放曲線Fig.2 Typical NO release curve of the SNAP catheter

圖3 SNAP 導管的NO 長期釋放曲線Fig.3 Long-term NO release curve of the SNAP catheter

2.3 SNAP 導尿管的體外抗菌性能

SNAP 導尿管對各試驗菌種的抑菌圈如圖4所示,抑菌圈直徑測量結(jié)果如表2 所示。在兩種導尿管放置方式的實驗中,SNAP 導尿管對金黃色葡萄球菌均具有清晰可見的抑菌圈,垂直插入法和平行放置法的抑菌圈直徑分別為2.59 mm 和2.75 mm,表明SNAP 導尿管對金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌效果。在其他菌種的測定結(jié)果中均未觀察到清晰的抑菌圈,表明SNAP 導尿管對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌沒有抑菌效果。

圖4 SNAP 導尿管、納米銀導尿管和一次性硅膠導尿管對不同菌種的抑菌圈實驗結(jié)果Fig.4 Experimental results showing the inhibition zones for the SNAP catheter, nano-silver catheter and disposable silica gel catheter against different strains

表2 SNAP 導尿管對不同菌種的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of the SNAP catheter against different strains

2.4 SNAP 導尿管的體內(nèi)抗菌性能

在臨床的尿常規(guī)檢測中,當尿液含菌量大于105cfu/mL 時,提示有泌尿系統(tǒng)感染。對各組留置導尿管后1、3、7、17 天的尿液進行尿常規(guī)檢測和尿液細菌學檢查,得到各組綿羊的尿液含菌量,如表3所示。結(jié)果顯示,總體上看留置SNAP 導尿管的綿羊組比留置納米銀導尿管組和硅膠導尿管組的尿液含菌量更低。在第17 天,留置SNAP 導尿管的綿羊尿液中未檢測到菌殘留;在留置納米銀導尿管組中,在第17 天有2 只綿羊的尿液含菌量大于105cfu/mL,有2 只綿羊的尿液含菌量為104～105cfu/mL,提示納米銀導尿管在體內(nèi)留置較長時間后會誘發(fā)尿路感染;在留置硅膠導尿管組中,在第15 天有1 只綿羊的尿液含菌量大于105cfu/mL。以上結(jié)果表明,相較于納米銀導尿管和硅膠導尿管,SNAP 導尿管具有較為明顯的抗菌效果。

表3 各實驗組在不同時間的綿羊尿液含菌量Table 3 Bacterial content in the urine of sheep in each experimental group at different times

3 結(jié)論

(1)SNAP 導管的典型NO 釋放曲線表明,在約600 s 時即可觀察到NO 的釋放(釋放量約0.3 ×10-10mol/(min·cm2)),此后NO 釋放量緩慢增加;NO 長期釋放曲線表明,在第1 天觀察到NO 的釋放量可達1.8 ×10-10mol/(min·cm2),此后NO 釋放量逐漸下降并可持續(xù)釋放20 天。

(2)體外抑菌實驗表明,SNAP 導尿管對金黃色葡萄球菌有較明顯的抑菌作用,垂直插入法和平行放置法測得的抑菌圈直徑分別為2.59 mm 和2.75 mm,但SNAP 導尿管對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌沒有抑菌作用。

(3)在體內(nèi)抗菌活性測定實驗中,在監(jiān)測17 天后,在SNAP 導尿管組的綿羊尿液中未檢測到細菌,而在納米銀導尿管組和硅膠導尿管組的綿羊尿液中均檢測出含菌量大于105cfu/mL。結(jié)果表明SNAP導尿管具有較好的體內(nèi)抗菌性能。