王 莉，曾文靖，王超文，羅臻碩，黃起壬

? 藥理與臨床 ?

氧化苦參堿對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的作用及機(jī)制

王 莉，曾文靖，王超文，羅臻碩，黃起壬*

南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330006

探討氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）對(duì)棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）胰島素抵抗（insulin resistance，IR）作用及機(jī)制。通過(guò)PA（0.25 mmol/L）誘導(dǎo)HUVECs建立IR模型后，進(jìn)行OMT的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系研究，篩選出OMT的最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間。CCK-8法檢測(cè)HUVECs活力；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察細(xì)胞形態(tài)；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路、激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白抑制因子1（protein inhibitor of activated STAT 1，PIAS1）蛋白表達(dá)；試劑盒檢測(cè)一氧化氮（nitric oxide，NO）水平。根據(jù)篩選出的OMT最佳濃度（4 μmol/L）和作用時(shí)間（48 h），敲低PIAS1進(jìn)行機(jī)制探討，Western blotting檢測(cè)PIAS1、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）蛋白表達(dá)；熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）檢測(cè)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；免疫熒光法觀察NF-κB p65核轉(zhuǎn)位情況。隨著OMT作用濃度和時(shí)間的增加，PI3K/Akt/eNOS通路和PIAS1蛋白表達(dá)量及NO水平均增加（＜0.05、0.01、0.001）。轉(zhuǎn)染Ad-PIAS1-RNAi后，NF-κB p65蛋白表達(dá)量、ROS和IL-6水平均顯著增加（＜0.01、0.001），NF-κB p65入核程度顯著增強(qiáng)（＜0.05、0.01），而OMT可以部分逆轉(zhuǎn)上述作用（＜0.05、0.01、0.001）。OMT能改善PA體外誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮IR，其機(jī)制主要是通過(guò)上調(diào)PIAS1通路減輕高脂誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

氧化苦參堿；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；棕櫚酸；胰島素抵抗；PIAS1；炎癥反應(yīng)；氧化應(yīng)激

隨著全球肥胖率的增加，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）以及相關(guān)心血管疾病的患病率也在增加[1]。IR是肥胖和2型糖尿病的共同病理特征[2]。IR涉及多種分子和病理生理機(jī)制，是代謝紊亂、脂毒性、糖毒性和炎癥等相互作用的結(jié)果[3]。血管內(nèi)皮IR是肥胖并發(fā)血管疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是滋生“代謝綜合征”的共同“土壤”[4]。現(xiàn)在普遍認(rèn)為IR也是一種慢性炎癥過(guò)程，炎癥導(dǎo)致IR的分子機(jī)制是近年研究的熱點(diǎn)之一。

氧化苦參堿是從豆科植物苦參Ait.中提取分離得到的一種喹諾里西啶類(lèi)生物堿，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、心血管保護(hù)等多種藥理作用[5-7]。研究表明，氧化苦參堿能夠抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，減輕內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[8-9]，從而為氧化苦參堿在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化中的作用提供了新的視角；然而，其確切的機(jī)制尚未完全闡明。激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白抑制因子（protein inhibitor of activated STAT，PIAS）是一類(lèi)活化的基因抑制蛋白。研究表明，PIAS1是一種E3連接酶，可以通過(guò)泛素化或類(lèi)泛素化蛋白修飾依賴(lài)途徑調(diào)控許多轉(zhuǎn)錄因子如Glis3的轉(zhuǎn)錄活性從而調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)[10]。已有研究表明氧化苦參堿可改善IR[11]，且可以調(diào)控腎小球細(xì)胞PIAS1蛋白表達(dá)[12]；同時(shí)課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PIAS1可SUMO化修飾過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ），從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮IR[13]。由此推測(cè)氧化苦參堿可能通過(guò)調(diào)控PIAS1影響棕櫚酸誘導(dǎo)的IR。因此，探明氧化苦參堿的這一作用將為IR相關(guān)心血管疾病的治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)于降低糖尿病患者心腦血管事件發(fā)生、改善患者生存質(zhì)量具有重要意義。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 藥品與試劑

氧化苦參堿（批號(hào)HY-NO158，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基、蘇木素-伊紅（HE）染液購(gòu)自北京Solarbio公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號(hào)A013-2-1）購(gòu)自南京建成生物；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)2H-KMLJ201）購(gòu)自南京卡米諾生物；熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C1300-1）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Ad-PIAS1-RNAi病毒（批號(hào)133511D）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、PIAS1、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗體（批號(hào)分別為5880S、3550S、17366S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；PI3K抗體（批號(hào)PTM-5198）購(gòu)自景杰生物；核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗體（批號(hào)00096033）購(gòu)自武漢三鷹；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號(hào)334286）購(gòu)自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司；Akt抗體（批號(hào)ET1607-73）購(gòu)自杭州華安生物；山羊抗小鼠二抗（批號(hào)BST17E27C17F50）、山羊抗兔二抗（批號(hào)BST17G08A17G54）、β-actin抗體（批號(hào)18C03A27）購(gòu)自武漢博士德生物。

1.3 儀器

SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈安泰公司）；Forma311型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；8K43352型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；DYY-6C型垂直電泳-轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）；Enspire 680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkinelmer公司）；A1HD25型激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 棕櫚酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IR模型的建立

參照文獻(xiàn)方法[14-16]建立HUVECs IR模型。用0.25 mmol/L的棕櫚酸作用于HUVECs 48 h，然后用胰島素（100 nmol/L）處理30 min[17]。

2.2 CCK-8篩選藥物安全范圍

將HUVECs均勻接種于96孔板上，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板70%時(shí)使用梯度濃度（0、2、4、8、16、32 μmol/L）的氧化苦參堿對(duì)HUVECs處理48 h，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力＝(樣品－校正)/(空白－校正)

2.3 氧化苦參堿最佳作用濃度和最佳孵育時(shí)間的確定

設(shè)置對(duì)照組、模型組和氧化苦參堿（2、4、8 μmol/L）組，除對(duì)照組外，其余各組用棕櫚酸和不同濃度的氧化苦參堿處理48 h，最后用胰島素（100 nmol/L）處理30 min，采用HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平，檢測(cè)細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS通路和PIAS1蛋白表達(dá)情況。

確定最佳作用濃度后，探究最佳作用時(shí)間。設(shè)置對(duì)照組、模型組和給藥組，除對(duì)照組外，其余各組用棕櫚酸處理48 h，給藥組用4 μmol/L氧化苦參堿分別處理24、36、48 h，最后用胰島素（100 nmol/L）處理30 min，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS通路蛋白表達(dá)情況。

2.4 敲減PIAS1對(duì)氧化苦參堿改善棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs IR的影響

根據(jù)篩選出的氧化苦參堿最佳濃度（4 μmol/L）和作用時(shí)間（48 h），設(shè)置對(duì)照＋空載病毒組、棕櫚酸＋空載病毒組、棕櫚酸＋氧化苦參堿＋空載病毒組、對(duì)照＋siRNA-PIAS1[18]組、棕櫚酸＋siRNA-PIAS1、棕櫚酸＋氧化苦參堿＋siRNA-PIAS1組，含棕櫚酸組均用0.25 mmol/L棕櫚酸處理48 h，含氧化苦參堿組均用4 μmol/L氧化苦參堿處理48 h，轉(zhuǎn)染組在進(jìn)行棕櫚酸和氧化苦參堿處理后，用無(wú)血清培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)染48 h，檢測(cè)細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS通路、PIAS1和NF-κB p65蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6含量，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.5 NO、IL-6水平的檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)NO和IL-6水平。

2.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，裂解提取蛋白，并測(cè)定總蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜，加入二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，用ELC化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，采用Image J軟件分析。

2.7 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，用PBS清洗干凈，用蘇木素染細(xì)胞核5 min，洗凈加入伊紅染細(xì)胞質(zhì)1 min，在顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照。

2.8 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)NF-κB p65亞細(xì)胞定位

將細(xì)胞均勻接種于激光共聚焦顯微鏡專(zhuān)用培養(yǎng)皿中。細(xì)胞經(jīng)分組處理后，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，隨后加入0.1% TritonX-100通透10 s，洗凈后加入5%牛血清白蛋白，室溫封閉2 h，然后加入NF-κB p65一抗（1∶800），4 ℃孵育過(guò)夜；次日加入熒光二抗（1∶400），室溫孵育2 h，然后DAPI（1∶10）染核5 min，PBS洗凈后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，利用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.9 ROS水平檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)分組處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞表面加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA（1∶1000），培養(yǎng)箱孵育30 min，PBS清洗干凈后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，并計(jì)算各組相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 氧化苦參堿對(duì)HUVECs活力、NO水平及細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖1-A所示，與對(duì)照組比較，2、4 μmol/L氧化苦參堿對(duì)HUVECs活力無(wú)明顯影響，8 μmol/L氧化苦參堿對(duì)細(xì)胞活力有影響（＜0.05），16、32 μmol/L氧化苦參堿顯著抑制細(xì)胞活力（＜0.01、0.001），具有一定的細(xì)胞毒性，因此確定藥物的安全濃度范圍0～8 μmol/L，選擇2、4、8 μmol/L的氧化苦參堿進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

如圖1-B所示，與對(duì)照組比較，模型組上清液中NO水平顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組NO水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），表明氧化苦參堿可以改善棕櫚酸導(dǎo)致的NO分泌受阻。如圖1-C所示，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)呈鵝卵石狀且輪廓清晰，排列緊密，貼壁良好；模型組細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞皺縮變長(zhǎng)失去原有形態(tài)；給予氧化苦參堿干預(yù)后，細(xì)胞逐漸恢復(fù)基本結(jié)構(gòu)，細(xì)胞輪廓逐漸清晰，細(xì)胞間間隙明顯縮小。

OMT-氧化苦參堿 與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.2 不同濃度氧化苦參堿對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為胰島素作用的靶細(xì)胞，胰島素可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的胰島素受體，進(jìn)而通過(guò)PI3K/Akt/eNOS通路誘導(dǎo)NO的分泌。若出現(xiàn)IR，則會(huì)導(dǎo)致PI3K/Akt/eNOS通路傳導(dǎo)障礙[19]。因此，考察了不同濃度氧化苦參堿對(duì)PI3K/Akt/eNOS通路蛋白表達(dá)的影響。如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.001），表明棕櫚酸誘導(dǎo)的IR模型建立成功[20]。與模型組比較，各給藥組細(xì)胞中PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），表明氧化苦參堿可改善棕櫚酸誘導(dǎo)的PI3K/Akt/eNOS通路傳導(dǎo)的障礙，且呈劑量相關(guān)性。

3.3 氧化苦參堿不同作用時(shí)間對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與模型組比較，氧化苦參堿處理24、36、48 h后PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。表明氧化苦參堿呈時(shí)間相關(guān)性地改善棕櫚酸誘導(dǎo)的該胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)的障礙。

圖2 不同濃度氧化苦參堿對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖3 氧化苦參堿不同作用時(shí)間對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.4 敲減PIAS1對(duì)氧化苦參堿改善IR的影響

如圖4所示，與對(duì)照＋空載病毒組比較，棕櫚酸＋空載病毒組PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01、0.001）；與棕櫚酸＋空載病毒組比較，棕櫚酸＋氧化苦參堿＋空載病毒組PI3K/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.01），表明氧化苦參堿可對(duì)抗棕櫚酸對(duì)PI3K/ Akt/eNOS通路的抑制作用，氧化苦參堿可改善棕櫚酸誘導(dǎo)的IR。敲減PIAS1后，氧化苦參堿對(duì)IR的改善作用被部分消除，表明氧化苦參堿改善IR的作用至少部分是由PIAS1介導(dǎo)。

3.5 敲減PIAS1對(duì)PIAS1、NF-κB p65表達(dá)及IL-6水平的影響

由于PIAS1是JNK/STAT炎癥應(yīng)激通路的抑制蛋白，故首先研究了不同濃度的氧化苦參堿是否能上調(diào)PIAS1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用。如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組PIAS1蛋白表達(dá)水平顯著下降（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組PIAS1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），呈劑量相關(guān)性，表明氧化苦參堿可以上調(diào)PIAS1表達(dá)。

為了探討氧化苦參堿發(fā)揮抗炎作用是否依賴(lài)于PIAS1，設(shè)計(jì)針對(duì)PIAS1的siRNA來(lái)下調(diào)PIAS1。

與空載對(duì)應(yīng)組別比較：&P＜0.05 &&P＜0.01 &&&P＜0.001，下圖同

圖5 PIAS1敲減對(duì)PIAS1、NF-κB p65表達(dá)及IL-6水平的影響(, n = 3)

結(jié)果顯示，與空載組比較，siRNA組PIAS1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），說(shuō)明PIAS1成功沉默。本研究還探究了敲低PIAS1對(duì)NF-κB p65蛋白表達(dá)和IL-6水平的影響，結(jié)果顯示，在PIAS1未敲減時(shí)，氧化苦參堿可逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的NF-κB p65表達(dá)和IL-6水平的增加（＜0.01），表明氧化苦參堿具有抗炎作用；在PIAS1敲減時(shí)，各組NF-κB p65表達(dá)和IL-6水平均較空載組顯著增加（＜0.01、0.001），說(shuō)明氧化苦參堿和PIAS1具有類(lèi)似抗炎作用，且氧化苦參堿的抗炎作用可被PIAS1敲減部分逆轉(zhuǎn)。

3.6 PIAS1敲減對(duì)NF-κB p65核移位的影響

NF-κB p65作為核轉(zhuǎn)錄因子，在正常情況下存在于細(xì)胞質(zhì)中，而發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)移入核。接下來(lái)探究了敲低PIAS1對(duì)NF-κB p65核移位的影響。如圖6所示，在PIAS1未敲減時(shí)，氧化苦參堿可逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的NF-κB p65核移位（＜0.05），表明氧化苦參堿具有抑制NF-κB p65核移位作用；在PIAS1敲減時(shí)，各組細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB p65水平均較空載組顯著增加（＜0.05、0.01），說(shuō)明氧化苦參堿和PIAS1具有類(lèi)似的抗NF-κB p65核移位作用，且氧化苦參堿的抗NF-κB p65核移位作用可被PIAS1敲減部分逆轉(zhuǎn)。

圖6 PIAS1敲減對(duì)NF-κB p65核移位的影響(, n = 3)

3.7 PIAS1敲減對(duì)ROS水平的影響

高脂血癥常伴有氧化應(yīng)激的增加。因此，探討了PIAS1敲減對(duì)氧化應(yīng)激的影響。如圖7所示，在PIAS1未敲減時(shí)，氧化苦參堿可逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的ROS水平增加（＜0.01），表明氧化苦參堿具有抗氧化應(yīng)激作用；在PIAS1敲減時(shí)，各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平均較空載組顯著增加（＜0.01、0.001），說(shuō)明氧化苦參堿和PIAS1具有類(lèi)似的抗氧化應(yīng)激作用，且氧化苦參堿的抗氧化應(yīng)激作用可被PIAS1敲減部分逆轉(zhuǎn)。

圖7 PIAS1敲減對(duì)ROS水平的影響(, n = 3)

4 討論

胰島素抵抗是代謝綜合征的關(guān)鍵組成部分，先于糖尿病、心血管疾病和阿爾茨海默病的發(fā)展。其病因途徑尚不明確，但已建立許多促成機(jī)制[21]。近年來(lái)，有很多關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞IR的研究，課題組前期已經(jīng)證實(shí)高脂可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR[13]，因此，本研究基于課題組前期構(gòu)建的細(xì)胞高脂模型進(jìn)行研究，采用0.25 mmol/L的棕櫚酸誘導(dǎo)HUVECs IR[19]，通過(guò)檢測(cè)NO水平和PI3K/Akt/eNOS通路蛋白表達(dá)，證實(shí)此模型構(gòu)建成功。

氧化苦參堿是一種天然生物活性化合物，具有改善IR的作用。研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠通過(guò)多種途徑改善IR，如抑制p38的磷酸化來(lái)緩解肝臟中的氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)肝臟KH型剪接調(diào)控蛋白（KH-type splicing regulatory protein，KSRP）、10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）和Akt表達(dá)，抑制炎癥通路NF-κB p65蛋白表達(dá)，直接調(diào)節(jié)胰島素PI3K/Akt/ eNOS通路，抑制炎癥因子水平等[6-8,11,22-23]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)氧化苦參堿能夠呈濃度和時(shí)間相關(guān)性改善棕櫚酸誘導(dǎo)的HUVECs IR，主要機(jī)制是通過(guò)減少炎癥因子IL-6的分泌、炎癥標(biāo)志性蛋白NF-κB p65的表達(dá)、氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS的生成以及抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。相關(guān)研究表明，PIAS1缺乏通過(guò)激活NF-κB途徑加重IR后心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[24]，過(guò)表達(dá)PIAS1會(huì)抑制炎癥[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，PIAS1敲減使HUVECs中總NF-κB p65含量顯著上升，對(duì)其細(xì)胞核內(nèi)含量影響大，這是由于在細(xì)胞核中PIAS1通過(guò)與p65的特異性結(jié)合充當(dāng)NF-κB的負(fù)調(diào)節(jié)因子，PIAS1阻止NF-κB二聚體與DNA上的κB位點(diǎn)對(duì)接，從而嚴(yán)格控制NF-κB介導(dǎo)的基因表達(dá)[27]，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步分別觀察胞質(zhì)和胞核NF-κB p65蛋白的表達(dá)量。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PIAS1的存在是對(duì)部分（17%～24%）基因進(jìn)行ROS依賴(lài)性調(diào)節(jié)的要求[28]。作為基因抑制蛋白，PIAS1敲減使ROS水平上調(diào)；而加入氧化苦參堿干預(yù)后，上述PIAS1敲減的效應(yīng)均能被顯著逆轉(zhuǎn)。表明氧化苦參堿調(diào)控PIAS1主要是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

綜上，本研究主要通過(guò)棕櫚酸建立IR模型，IR會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞受損。通過(guò)氧化苦參堿干預(yù)治療可以減輕炎癥和氧化應(yīng)激。氧化苦參堿也可以通過(guò)增加PIAS1蛋白表達(dá)減輕IR，這為防治糖尿病提供一條新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of oxymatrine on human umbilical vein endothelial cells insulin resistance induced by palmitic acid

WANG Li, ZENG Wen-jing, WANG Chao-wen, LUO Zhen-shuo, HUANG Qi-ren

College of Pharmacy, Nanchang University, Nanchang 330006, China

To explore the effect and mechanism of oxymatrine (OMT) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) insulin resistance (IR) induced by palmitic acid (PA).IR model was established by PA (0.25 mmol/L)-induced HUVECs. The dose-effect relationship and time-effect relationship of OMT were studied, and the optimal concentration and time of OMT were selected. The cell viability was examined by CCK-8. The cell morphology was observed by HE staining. The protein expressions of phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase (p-PI3K)/protein kinase B (Akt)/endothelial nitric oxide synthase (eNOS) pathway and protein inhibitor of activated STAT 1 (PIAS1) were detected by Western blotting. Nitric oxide (NO) level was detected by kit. According to the optimal concentration (4 μmol/L) of OMT and action time (48 h), the mechanism of knocking down PIAS1 was discussed. PIAS1 and nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) protein expressions were determined by Western blotting. The generation of reactive oxygen species (ROS) was observed by fluorescence probe 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Interleukin-6 (IL-6) level was detected by ELISA. NF-κB p65 nuclear translocation was determined by immunofluorescence.The protein expressions of PI3K/Akt/eNOS pathway and PIAS1 and NO level were significantly increased with the concentration and treatment time of OMT increased (< 0.05, 0.01, 0.001). After infection with Ad-PIAS1-RNAi, NF-κB p65 protein expression and levels of ROS, IL6 were significantly increased (< 0.01, 0.001), and the NF-κB p65 nuclear translocation was significantly enhanced (< 0.05, 0.01). The above effects produced by Ad-PIAS1-RNAi were partially reversed by OMT intervention (< 0.05, 0.01, 0.001).OMT can improve IR by up-regulating PIAS1 pathway to alleviate the inflammation and oxidative stress induced by PA in vascular endothelium.

oxymatrine; human umbilical vein endothelial cells; palmitic acid; insulin resistance; PIAS1; inflammation; oxidative stress

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4530 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.013

2023-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81960153）；南昌大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目（2022CX267）

王 莉（1999—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌代謝性疾病藥理學(xué)。E-mail: 2211292469@qq.com

黃起壬（1967—），男，教授，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌代謝性疾病藥理學(xué)。E-mail: qrhuang@ncu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]