魏柯健，俞靜靜，蘇 潔，徐 潔，胡雪靈，周衡樸，何梓雯，顏美秋，陳素紅，呂圭源*

復(fù)方野菊花提取物對(duì)肝火亢盛型高血壓模型大鼠的作用研究

魏柯健1，俞靜靜1，蘇 潔1，徐 潔1，胡雪靈1，周衡樸1，何梓雯1，顏美秋1，陳素紅2*，呂圭源1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053 2. 浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310014

探討復(fù)方野菊花提取物對(duì)肝火亢盛型高血壓大鼠模型的影響及降壓作用機(jī)制。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）ig復(fù)方附子湯建立肝火亢盛型高血壓大鼠模型，給予復(fù)方野菊花提取物干預(yù)后，檢測(cè)大鼠中醫(yī)證候指標(biāo)、心率和血壓，測(cè)定血清與腎臟中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone dystem，RAAS）相關(guān)因子的含量，檢測(cè)血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）及血脂水平，觀察靶器官組織形態(tài)學(xué)變化。復(fù)方野菊花提取物能顯著降低模型大鼠眩暈恢復(fù)時(shí)間、面溫、耳溫、尿液吸光度（＜0.01），增加唾液分泌量及糞便含水量（＜0.01），緩解模型大鼠尖叫、攻擊、打斗、撕咬等攻擊性行為；顯著降低模型大鼠心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓（＜0.05、0.01）；顯著降低血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）和ET-1水平（＜0.01），升高NO水平（＜0.01）；改善心臟、腎臟及胸主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)異常；降低血清中醛固酮（aldosterone，ALD）、腎素、血管緊張素-II（angiotensin-II，Ang-II）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）水平（＜0.05、0.01），降低腎臟腎素、Ang-II、ACE和胸主動(dòng)脈Ang-II的蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），增加腎臟ACE2蛋白表達(dá)（＜0.01）。復(fù)方野菊花提取物能夠緩解高血壓模型大鼠肝火亢盛證，改善模型大鼠的內(nèi)皮狀態(tài)，其降壓機(jī)制可能與抑制RAAS過(guò)度激活有關(guān)。

野菊花；高血壓；肝火亢盛證；腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)；京尼平苷酸；金絲桃苷；蒙花苷

高血壓屬于我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”的范疇，可分為肝火亢盛、痰濕壅盛、陰虛陽(yáng)亢、陰陽(yáng)兩虛等證型[1]，其中，肝火亢盛型在高血壓人群中占多數(shù)，且呈年輕化的趨勢(shì)[2-3]。其原因與現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快，人們精神壓力變大，飲食娛樂(lè)生活豐富，或任意嗜辣，或通宵達(dá)旦，致使肝陰受損而加重肝火亢盛證有關(guān)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，肝火亢盛型高血壓病理機(jī)制多樣，以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）激活、交感神經(jīng)亢奮及內(nèi)皮功能異常為主[6-8]。其中，RAAS是平衡血壓的重要途徑，腎內(nèi)RAAS的不適當(dāng)激活是高血壓的重要發(fā)病機(jī)制，其作用由醛固酮（aldosterone，ALD）、腎素、血管緊張素II（angiotensin-II，Ang-II）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）等多個(gè)受體共同負(fù)責(zé)[9]。內(nèi)皮被認(rèn)為是調(diào)節(jié)血管張力的重要組織，在多個(gè)心血管疾病尤其是高血壓的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，同時(shí)內(nèi)皮功能異常可能導(dǎo)致RAAS的過(guò)度激活[10]。

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（2002年版）中《中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導(dǎo)原則》診斷標(biāo)準(zhǔn)，肝火亢盛證主證為眩暈、頭痛及急躁易怒，次癥包括便秘、面紅目赤、口苦口干、溲赤、舌紅黃、脈弦數(shù)，中醫(yī)多以清肝、平肝、泄火為高血壓肝火亢盛證的主要治療原則。本課題組根據(jù)高血壓肝火亢盛證的病證特點(diǎn)，結(jié)合臨床高血壓“平肝潛陽(yáng)、清熱瀉火、滋補(bǔ)肝腎”之治則，在現(xiàn)有中成藥強(qiáng)力定眩片的處方基礎(chǔ)上加減，輔以具“清瀉肝火、平肝熄風(fēng)”之功的羅布麻葉，與野菊花、杜仲共同配伍制成復(fù)方野菊花提取物，或可在改善眩暈、頭痛之證的同時(shí)，起到緩解肝火亢盛證的作用。在對(duì)復(fù)方野菊花提取物的前期研究中發(fā)現(xiàn)[11]，復(fù)方野菊花提取物具有降低血壓的作用，其降壓機(jī)制與抑制RAAS的過(guò)度激活有關(guān)，但尚未明確其對(duì)高血壓中醫(yī)證候的影響。因此，本研究對(duì)復(fù)方野菊花提取物進(jìn)行成分分析，并采用課題組前期通過(guò)ig溫燥藥方法建立肝火亢盛型高血壓大鼠模型[12]，以眩暈恢復(fù)時(shí)間量化“眩暈”，性情分級(jí)量化“急躁易怒”，面部溫度量化“面紅”，唾液分泌量量化“口干”，糞便含水量量化“便秘”，尿液吸光度量化“溲赤”，結(jié)合其他藥效指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)復(fù)方野菊花提取物對(duì)肝火亢盛型高血壓模型大鼠中醫(yī)證候的改善作用，并基于前期藥效研究探討其降壓機(jī)制，為復(fù)方野菊花提取物臨床功能主治的確定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)WKY雄性大鼠10只，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g；SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）50只，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g；均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)110011210112172413、110011210112172584。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ZSLL-2017-185）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方附子湯由附子、干姜、肉桂組成，附子（批號(hào)201201）、干姜（批號(hào)210301）、肉桂（批號(hào)201901）均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，取上述藥材（1∶1∶1），浸泡0.5 h，分別加12、10倍量水煎煮2次，每次1 h，濾過(guò)后混合濃縮為含生藥1 g/mL的藥液；復(fù)方野菊花提取物（批號(hào)202710）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥與健康產(chǎn)品研究所提供，由野菊花、杜仲、羅布麻葉提取制得，以純水配制成質(zhì)量濃度為含生藥量0.525、0.350、0.175 g/mL的藥液；卡托普利片（批號(hào)20110511）購(gòu)自常州制藥廠有限公司，以純水配制成1.0 mg/mL的混懸液備用；對(duì)照品京尼平苷酸（批號(hào)111828-201805）、蒙花苷（批號(hào)111528-201911）、金絲桃苷（批號(hào)111521-201809）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.1%、94.9%、98.5%；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號(hào)210901201）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）試劑盒（批號(hào)220623202）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號(hào)201015101）均購(gòu)自美康生物科技股份有限公司；ALD、腎素、Ang-II、ACE試劑盒（批號(hào)分別為20220110-RXJ302392R、20220110-RX302359R、20220113-RX301962R、20211203-RX300267R）均購(gòu)自泉州市睿信生物科技有限公司；內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）試劑盒（批號(hào)23011760）購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號(hào)20220119）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Ang-II抗體（批號(hào)ab155106）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；腎素抗體（批號(hào)bs-6184R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ACE、ACE2抗體（批號(hào)分別為24743-1-AP、21115-1-AP）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源β-actin抗體（批號(hào)B9901）購(gòu)自美國(guó)Immuno Way公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)HP0119）購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

1200型高效液相色譜儀、Chemstation色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；BP-2010AUL型小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)測(cè)壓系統(tǒng)（北京軟隆生物科技有限公司）；TBA-40FR型全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝三廣醫(yī)療株式會(huì)社）；Power wave340型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；YHW-2型紅外測(cè)溫儀（江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；ZH-SZ型平衡旋轉(zhuǎn)儀（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；FLIR ONE Pro紅外熱像儀（美國(guó)FLIR公司）；Tissue-Tek VIPTM 5Jr型全封閉組織脫水機(jī)（日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社）；EC360型包埋機(jī)（美康儀器設(shè)備制造高淳縣有限公司）；RM2245型半自動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

2 方法

2.1 復(fù)方野菊花提取物含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Eclipse XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，7% A；5～15 min，7%～8% A；15～25 min，8%～13% A；25～30 min，13%～17% A；30～45 min，17%～19% A；45～50 min，19%～26% A；50～60 min，26%～27% A；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)403 nm（0～5 min），240 nm（5～26 min），403 nm（26～37 min），256 nm（37～43 min），330 nm（43～60 min）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取對(duì)照品京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷各適量，置量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，密塞，搖勻，得分別含京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷0.124 8、0.148 0、0.173 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備：取復(fù)方野菊花提取物樣品約0.5 g，精密稱取，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.1.3 線性關(guān)系的考察及測(cè)定 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液；分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制回歸方程。取供試品續(xù)濾液，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷的含量。

2.2 分組、造模與給藥

雄性SHR大鼠ig溫燥藥（0.2 g/mL復(fù)方附子湯）造模，連續(xù)造模5周后，通過(guò)血壓監(jiān)測(cè)及肝火亢盛證相關(guān)指標(biāo)評(píng)估，選取造模成功，即血壓穩(wěn)定在收縮壓≥220 mm Hg（1 mm Hg＝133 Pa）且出現(xiàn)肝火亢盛證的大鼠。按血壓值隨機(jī)分為模型組、卡托普利（10 mg/kg）組和復(fù)方野菊花提取物高、中、低劑量（5.25、3.50、1.75 g/kg）組，每組10只；繼續(xù)ig溫燥藥造模。另取WKY大鼠10只作為對(duì)照組。各給藥組ig相應(yīng)藥物（0.01 mL/g），對(duì)照組和模型組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。

2.3 中醫(yī)證候指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 性情變化 將大鼠性情變化分為I～I(xiàn)V級(jí)，分別為：I級(jí)，無(wú)明顯表現(xiàn)；II級(jí)，有輕微抽搐；III級(jí)，發(fā)出叫聲且用力抖動(dòng)；IV級(jí)，用力掙脫且表現(xiàn)攻擊趨向。于給藥前、給藥28 d后，觀察大鼠性情并進(jìn)行評(píng)級(jí)。

2.3.2 眩暈恢復(fù)時(shí)間 于給藥前、給藥28 d后，將大鼠置于平衡旋轉(zhuǎn)儀上，1000 r/min旋轉(zhuǎn)1 min后取下，然后將其放置于平臺(tái)上，記錄大鼠恢復(fù)正常狀態(tài)所需時(shí)間。

2.3.3 面溫 于給藥前、給藥28 d后，安靜環(huán)境下，用非接觸式紅外測(cè)溫儀對(duì)準(zhǔn)大鼠面部，當(dāng)測(cè)溫儀穩(wěn)定后記錄所測(cè)數(shù)據(jù)，測(cè)定3次，取平均值。

2.3.4 唾液分泌量 于給藥前、給藥28 d后，將干燥棉簽置于干燥小型密封袋中稱定得到干質(zhì)量，再以干燥棉簽收集大鼠口腔中的唾液，將棉簽再放入密封袋中，避免唾液蒸發(fā)，稱定得到濕質(zhì)量，計(jì)算唾液分泌量。

唾液分泌量＝濕質(zhì)量－干質(zhì)量

2.3.5 糞便含水率 于給藥前、給藥28 d后，收集大鼠糞便，立即稱定記為糞便濕質(zhì)量，于70 ℃烘箱烘5 h，再次稱定記為糞便干質(zhì)量，計(jì)算糞便含水率。

糞便含水率＝(糞便濕質(zhì)量－糞便干質(zhì)量)/糞便濕質(zhì)量

2.3.6 尿液吸光度（） 于給藥前、給藥28 d后，采用代謝籠收集大鼠新鮮尿液200 μL，在430 nm下測(cè)定值。

2.3.7 耳溫 給藥28 d后，在安靜環(huán)境下，用FLIR ONE Pro紅外熱像儀對(duì)大鼠耳部進(jìn)行紅外拍攝，測(cè)得大鼠耳部溫度。

2.4 血壓、心率監(jiān)測(cè)

于給藥前以及給藥1、3、7、14、21、28 d后，采用小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)測(cè)壓系統(tǒng)，在大鼠清醒且安靜環(huán)境下平行測(cè)定大鼠收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓，于給藥前、給藥28 d后測(cè)定大鼠心率。

2.5 血脂水平檢測(cè)

末次給藥后，各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，4 ℃凝血2 h，3500 r/min離心15 min，取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TG、TC、LDL-C水平。

2.6 血清NO和ET-1水平檢測(cè)

取大鼠血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中ET-1和NO含量。

2.7 血清ALD、ACE、Ang-II和腎素水平檢測(cè)

取大鼠血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中ALD、腎素、Ang-II和ACE的含量。

2.8 心臟、腎臟和胸主動(dòng)脈組織病理學(xué)觀察

末次給藥后，ip 0.2 g/mL烏拉坦麻醉大鼠（5 mL/kg）。用鑷子夾其腳趾無(wú)反應(yīng)后，將大鼠仰臥在手術(shù)臺(tái)上，沿腹中線解剖取大鼠心臟、腎臟和胸主動(dòng)脈，放入盛有10%中性福爾馬林緩沖液的瓶中。經(jīng)固定、取材、脫水、包埋、切片，制得4 μm石蠟切片，采用蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色，中性樹(shù)脂封片，干燥后于顯微鏡下觀察心臟、腎臟及胸主動(dòng)脈組織病理變化。

2.9 免疫組化法檢測(cè)腎臟中ACE、ACE2和胸主動(dòng)脈Ang-II的蛋白表達(dá)

取腎臟和胸主動(dòng)脈的石蠟切片（4 μm），經(jīng)過(guò)消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性、抗原修復(fù)、牛血清白蛋白封閉后，滴加ACE、ACE2、Ang-II抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；經(jīng)DAB顯色、蘇木素染色、乙醇脫水及中性樹(shù)脂封片干燥后，于顯微鏡下觀察腎臟中ACE、ACE2和胸主動(dòng)脈Ang-II蛋白的表達(dá)情況，并用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

2.10 Western blotting檢測(cè)腎臟中腎素和Ang-II的蛋白表達(dá)

取腎臟組織，液氮充分研磨后，加入適量RIPA裂解液，冰上靜置10 min，離心取上清，提取組織蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入腎素、Ang-II抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗，室溫孵育2 h；PBST洗膜3次，每次15 min；加入ECL化學(xué)發(fā)光液后，采用Modena凝膠成像儀檢測(cè)蛋白條帶，并用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方野菊花提取物含量測(cè)定

分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1）。復(fù)方野菊花提取物平行檢測(cè)3次，測(cè)定成分的色譜峰分離度（）均≥1.5，測(cè)得京尼平苷酸、金絲桃苷、蒙花苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（2.710±0.150）、（3.470±0.147）、（10.690±0.529）mg/g。

1-京尼平苷酸 2-金絲桃苷 3-蒙花苷

3.2 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠中醫(yī)證候指標(biāo)的影響

3.2.1 對(duì)性情的影響 如圖2所示，與對(duì)照組比較，給藥前各組大鼠具有顯著的攻擊表現(xiàn)（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的攻擊性（＜0.05、0.01）。

3.2.2 對(duì)眩暈恢復(fù)時(shí)間的影響 如圖3所示，與對(duì)照組比較，給藥前各組大鼠的眩暈恢復(fù)時(shí)間顯著上升（＜0.05、0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的眩暈恢復(fù)時(shí)間（＜0.01）。

NC-對(duì)照組 MC-模型組 CAP-卡托普利組 FYH-復(fù)方野菊花提取物高劑量組 FYM-復(fù)方野菊花提取物中劑量組 FYL-復(fù)方野菊花提取物低劑量組 與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠中醫(yī)證候指標(biāo)的影響(, n = 10)

3.2.3 對(duì)面溫的影響 與對(duì)照組比較，給藥前各組大鼠的面溫顯著上升（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的面溫（＜0.01）。

3.2.4 對(duì)唾液分泌量的影響 與對(duì)照組比較，給藥前各組大鼠的唾液分泌量顯著減少（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著增加模型大鼠的唾液分泌量（＜0.01）。

3.2.5 對(duì)糞便含水率的影響 與對(duì)照組比較，給藥前各組大鼠的糞便含水率顯著降低（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著增加模型大鼠的糞便含水率（＜0.01）。

3.2.6 對(duì)尿液值的影響 與對(duì)照組比較，給藥前各組大鼠的尿液值均顯著上升（＜0.01）；給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的尿液值（＜0.01）。

3.2.7 對(duì)耳溫的影響 與對(duì)照組比較，給藥28 d后，模型組大鼠的平均耳溫均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠的平均耳溫（＜0.01）。

3.3 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠心率和血壓的影響

3.3.1 對(duì)模型大鼠心率的影響 如圖4所示，與對(duì)照組比較，給藥前各組大鼠心率均明顯升高（＜0.05、0.01）；給藥28 d后，中、高劑量的復(fù)方野菊花提取物能顯著降低模型大鼠心率（＜0.01），復(fù)方野菊花提取物低劑量組心率有降低趨勢(shì)。

3.3.2 對(duì)模型大鼠血壓的影響 與對(duì)照組比較，給藥前模型組在造模后不同時(shí)間點(diǎn)舒張壓均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，給藥1、3、7、14、21、28 d后，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能穩(wěn)定顯著降低模型大鼠收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓（＜0.05、0.01）。

3.4 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠血脂水平的影響

如圖5所示，給藥28 d后，與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠血清中TC、LDL-C含量（＜0.01），復(fù)方野菊花提取物高劑量組顯著降低模型大鼠血清中TG含量（＜0.01），復(fù)方野菊花提取物低、中劑量組對(duì)TG含量有降低趨勢(shì)。

圖4 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠心率和血壓的影響(, n = 10)

圖5 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響(, n = 10)

3.5 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠血清中NO及ET-1含量的影響

如圖6所示，給藥28 d后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ET-1含量顯著升高（＜0.01），NO含量顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低血清中ET-1含量（＜0.05、0.01），復(fù)方野菊花提取物高劑量組能顯著升高血清中NO含量（＜0.01），復(fù)方野菊花提取物低、中劑量組對(duì)NO含量有升高趨勢(shì)。

3.6 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠血清RAAS相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖7所示，給藥28 d后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中腎素、Ang-II、ACE、ALD含量均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能顯著降低模型大鼠血清中腎素、Ang-II、ACE含量（＜0.05、0.01），復(fù)方野菊花提取物低、高劑量組能顯著降低ALD含量（＜0.05），復(fù)方野菊花提取物中劑量組對(duì)ALD呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

圖6 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠血清中NO及ET-1含量影響(, n = 10)

圖7 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠血清中RAAS相關(guān)指標(biāo)的影響(, n = 10)

3.7 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠靶器官組織形態(tài)的影響

3.7.1 對(duì)模型大鼠腎臟組織形態(tài)的影響 如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織HE染色可見(jiàn)腎小球萎縮，腎小管排列紊亂及間隙增大；Masson染色可見(jiàn)腎小管間隙出現(xiàn)大量藍(lán)紫色膠原蛋白沉積。與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物對(duì)大鼠腎臟病變有不同程度的改善，腎小球、腎小管形態(tài)接近對(duì)照組，腎小球萎縮明顯改善，腎小管間隙無(wú)顯著膠原蛋白沉積。

3.7.2 對(duì)模型大鼠心臟組織形態(tài)的影響 如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心臟組織HE染色可見(jiàn)心肌纖維排列不規(guī)則，同時(shí)心肌細(xì)胞核深染、肥大、間距變寬、排列紊亂；Masson染色可見(jiàn)心肌纖維間出現(xiàn)大量藍(lán)紫色膠原蛋白沉積。與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均能使心肌組織結(jié)構(gòu)趨于正常，橫紋較清晰，心肌細(xì)胞肥大改善，形態(tài)較規(guī)則，心肌纖維間膠原蛋白沉積面積顯著減小。

3.7.3 對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)的影響 如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織HE染色可見(jiàn)中膜明顯增厚，血管平滑肌細(xì)胞排列疏松、紊亂，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不齊且部分脫落；Masson染色可見(jiàn)中膜出現(xiàn)大量藍(lán)紫色的膠原蛋白沉積。與模型組比較，各劑量的復(fù)方野菊花提取物均可使胸主動(dòng)脈中膜增厚、血管平滑肌細(xì)胞增生且排列紊亂等癥狀減輕，中膜膠原蛋白沉積顯著減小。

圖8 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響 (×200)

圖9 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響(×200)

圖10 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的影響(×200)

3.8 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠腎臟ACE、ACE2及胸主動(dòng)脈Ang-II表達(dá)的影響

3.8.1 對(duì)模型大鼠腎臟ACE和ACE2表達(dá)的影響 如圖11所示，大鼠腎臟中ACE2、ACE染色陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)在腎小管細(xì)胞，呈棕黃色。與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟中ACE2表達(dá)明顯降低（＜0.01），ACE表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方野菊花提取物各劑量組大鼠腎臟中ACE表達(dá)均顯著降低（＜0.01），ACE2表達(dá)均明顯升高（＜0.01）。

3.8.2 對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈Ang-II表達(dá)的影響 如圖12所示，胸主動(dòng)脈中Ang-II染色陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞表面，呈棕黃色。與對(duì)照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈中Ang-II表達(dá)顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方野菊花提取物各劑量組胸主動(dòng)脈Ang-II蛋白表達(dá)顯著減少（＜0.01）。

圖11 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠腎臟ACE和ACE2表達(dá)的影響(, n = 3)

圖12 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈Ang-II表達(dá)的影響(, n = 3)

3.9 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠腎臟中腎素和Ang-II蛋白表達(dá)的影響

如圖13所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟中腎素和Ang-II表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，復(fù)方野菊花提取物各劑量組腎臟中Ang-II表達(dá)明顯減少（＜0.05），復(fù)方野菊花提取物中、高劑量組腎素表達(dá)顯著減少（＜0.05），復(fù)方野菊花提取物低劑量組腎素的表達(dá)呈降低趨勢(shì)。

圖13 復(fù)方野菊花提取物對(duì)模型大鼠腎臟腎素和Ang-II蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

高血壓的病因大致有“風(fēng)、火、痰、瘀、虛”等[13]，肝風(fēng)、腎虛、痰濁則是其主要病理基礎(chǔ)[14]。高血壓病常伴有眩暈、頭痛等主證，但不同證候類(lèi)型的高壓病其病因病機(jī)不同，其主次之證的側(cè)重點(diǎn)亦不相同，如若飲食不節(jié)，多食肥甘厚味，痰濕內(nèi)生，而發(fā)為痰濕壅盛型，其主證表現(xiàn)為胸悶、嘔吐痰涎并伴有失眠、耳鳴、健忘等次證；年老體衰、久病體虛，腎陰虧虛，陽(yáng)亢于上，形成陰虛陽(yáng)亢型，其主證表現(xiàn)為腰酸、膝軟、五心煩熱，伴有失眠、耳鳴、健忘等次證；久病陰損及陽(yáng)，則出現(xiàn)陰陽(yáng)兩虛，其主證表現(xiàn)為畏寒肢冷，伴有氣短、夜尿頻等次證[2]。而肝火亢盛證為實(shí)證，其病位在肝，病性為火，其主證主要表現(xiàn)為急躁易怒，并伴有面紅、目赤、口干、口苦、便秘、瘦赤等次證[15]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝火亢盛證為早期高血壓病的主要證候，而高血壓與肝的關(guān)系自古便有論述，如《素問(wèn)·至真要大論》有言：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”?！杜R證指南醫(yī)案》進(jìn)一步指出：“所患眩暈者，非外來(lái)之邪，乃肝膽之風(fēng)陽(yáng)上冒耳”，而究其“火”之病性，多因情志不暢、飲食辛辣或作息不律致肝氣郁結(jié)，滯而為火，火為陽(yáng)邪，燔灼于內(nèi)則耗氣傷津，致肝陰不足。肝風(fēng)遇火，風(fēng)火相煽，發(fā)為眩暈[16]。故而肝火內(nèi)熾、氣火上逆是為肝火亢盛型高血壓的主要病機(jī)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為火氣失常是某些疾病的重要原因[17]，現(xiàn)代中醫(yī)在肝火亢盛證的臨床診療中亦發(fā)現(xiàn)“火”可致機(jī)體多方面的損傷或不適，如火性炎上，上擾清空可使神明不安，出現(xiàn)眩暈、頭痛；肝火循經(jīng)上攻于頭目，進(jìn)而氣血隨之上涌，出現(xiàn)面赤、目赤等癥狀[18]，大多與肝火亢盛證的表現(xiàn)相符。本實(shí)驗(yàn)采用“大熱”的溫燥藥進(jìn)行造模，引火入肝，成功在自發(fā)性高血壓的基礎(chǔ)上使大鼠出現(xiàn)肝火亢盛高血壓主證眩暈、急躁易怒，次癥便秘、面紅、口干、溲赤。

復(fù)方野菊花提取物以野菊花為君，其味苦辛、涼，入肝、心經(jīng)，可清熱解毒，瀉火平肝[20]，《本草綱目》中稱有“利五脈、調(diào)四肢，治頭風(fēng)熱、腦骨腫痛、養(yǎng)目血、去翳膜、主肝氣不足”之功，主治頭眩腫痛、頭目風(fēng)熱等癥；配以羅布麻葉平肝安神，清熱利水[19]，與野菊花共去肝臟邪火，以平肝陽(yáng)眩暈；佐以杜仲，補(bǔ)肝腎不足[19]，助野菊花復(fù)肝腎正氣而治頭暈?zāi)垦?。諸藥合用，共達(dá)清肝熱、平肝陽(yáng)、養(yǎng)肝腎、涼血散結(jié)之功，使人體趨于陰平陽(yáng)秘、血脈平和，從而緩解肝火亢盛證。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方野菊花提取物可有效降低模型大鼠的心率與血壓，并改善模型大鼠性情狀況，降低眩暈恢復(fù)時(shí)間、面溫、耳溫、尿液值，增加唾液分泌量、糞便含水量。證明復(fù)方野菊花提取物能夠在降壓的同時(shí)有效改善模型大鼠“眩暈”“急躁易怒”“口干”“溲赤”“耳赤”等證候指標(biāo)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)高血壓的病理機(jī)制是多個(gè)生物因子相互作用的結(jié)果。薛曉興等[20]認(rèn)為RAAS中Ang-II可作為高血壓肝火亢盛證的標(biāo)志性物質(zhì)，Ang-II是RAAS的主要效應(yīng)因子，是一種由腎素和ACE共同作用而形成的強(qiáng)效血管收縮劑[21-22]。同時(shí)，Ang-II可通過(guò)誘導(dǎo)活性氧的生成，從而抑制NO的生成和活性[23]。NO為內(nèi)皮依賴性舒張血管因子，其含量與生物活性的變化能反映內(nèi)皮功能的狀態(tài)，與收縮血管因子ET-1構(gòu)成了一對(duì)具有拮抗效應(yīng)的血管活性物質(zhì)[24]。而ET-1可刺激RAAS，并可介導(dǎo)Ang-II引起的心血管損傷[25]。此外，長(zhǎng)期血壓過(guò)高將導(dǎo)致脂代謝紊亂，而肝火亢盛證高血壓病患者的TG、TC、LDL-C水平相對(duì)高于其他證型患者[26-27]。機(jī)體在LDL-C、TC水平長(zhǎng)期升高的狀態(tài)下，將導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[28]，內(nèi)皮功能受到損害，使NO減少，造成內(nèi)皮舒縮因子（ET-1/NO）的失衡，血壓持續(xù)升高，促進(jìn)高血壓的發(fā)生發(fā)展[29]。另有研究表明TG是高血壓的重要危險(xiǎn)因素，控制TG水平可減緩高血壓的發(fā)病[30]。目前，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)京尼平苷酸、金絲桃苷和蒙花苷可以起到降壓作用，其中金絲桃苷和蒙花苷可有效抑制Ang-II的表達(dá)而降低高血壓血管的張力[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方野菊花提取物能明顯降低模型大鼠血清中ALD、腎素、Ang-II、ACE水平，下調(diào)腎臟中腎素、ACE、Ang-II和主動(dòng)脈中Ang-II的蛋白表達(dá)，上調(diào)ACE2的蛋白表達(dá)。說(shuō)明復(fù)方野菊花提取物可能是通過(guò)抑制循環(huán)和腎臟局部RAAS的過(guò)度激活而起到降低血壓的作用。進(jìn)一步對(duì)血清進(jìn)行生化分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)方野菊花提取物能夠降低模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C的水平，同時(shí)調(diào)節(jié)ET-1/NO的失衡，改善內(nèi)皮功能。結(jié)合病理學(xué)觀察，復(fù)方野菊花提取物能夠有效改善模型大鼠腎、心、主動(dòng)脈等臟器的損傷，減輕高血壓對(duì)機(jī)體的損傷。

綜上，復(fù)方野菊花提取物能夠有效改善肝火亢盛諸證和心臟、腎臟、主動(dòng)脈等靶器官的損傷，并通過(guò)抑制RAAS過(guò)度激活起到降壓作用，同時(shí)調(diào)節(jié)血脂代謝進(jìn)而改善血管內(nèi)皮功能，最終起到改善肝火亢盛證高血壓的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of compoundextract on hypertensive model rats with liver-fire hyperactivity syndrome

WEI Ke-jian1, YU Jing-jing1, SU Jie1, XU Jie1, HU Xue-ling1, ZHOU Heng-pu1, HE Zi-wen1, YAN Mei-qiu1, CHEN Su-hong2, LYU Gui-yuan1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

To explore the effect and hypotensive mechanism of compoundextract on hypertensive model rats with liver-fire hyperactivity syndrome.Spontaneously hypertensive rats (SHR) were ig compound Fuzi Decoction (復(fù)方附子湯) to induce hypertensive model with liver-fire hyperactivity syndrome, after the intervention of compoundextract, the indexes of TCM syndromes, heart rate and blood pressure of rats were monitored, the contents of renin-angiotensin-aldosterone dystem (RAAS) related factors in serum and kidney were measured, the levels of nitric oxide (NO), endothelin-1 (ET-1) and blood lipids in serum were detected, and the histomorphological changes of kidney, heart and aorta were observed.Compoundextract could significantly reduce the recovery time of vertigo, face temperature, ear temperature and urine absorbance (< 0.01), increase saliva secretion and fecal water content (< 0.01), and alleviate the temperament changes of model rats such as screaming, fighting and biting. Compoundextract significantly decrease heart rate, systolic blood pressure, diastolic blood pressure and mean arterial pressure (< 0.05, 0.01), reduce total cholesterol (TC), triacylglycerol (TG), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) and ET-1 levels in serum (< 0.01), while increase NO level (< 0.01). Compoundextract could improve the abnormal tissue structure of heart, kidney and thoracic aorta, reduce the levels of aldosterone (ALD), renin, angiotensin-II (Ang-II) and angiotensin converting enzyme (ACE) in serum (< 0.05, 0.01), reduce the protein expressions of renin, Ang-Ⅱ, ACE in kidney and Ang-Ⅱ in thoracic aorta (< 0.05, 0.01), increase the protein expression of ACE2 in kidney (< 0.01).Compoundextract can alleviate liver-fire hyperactivity syndrome in hypertensive model rats, improve the endothelial status of hypertensive model rats, and its hypotensive mechanism may be related to the inhibition of RAAS over activation.

(L.) Des Moul.; hypertension; liver-fire hyperactivity syndrome; renin-angiotensin-aldosterone system; geniposidic acid; hyperoside; buddleoside

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4573 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.018

2023-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873036）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82003977）；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017C03052，2020C04020）；浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2012E10002）

魏柯健，碩士研究生，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究。E-mail: wkj_955@163.com

呂圭源，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究。E-mail: lv.gy@263.net

陳素紅，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究。E-mail: chensuhong@zjut.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]