石雙慧，王夢(mèng)琳，魏曉彤，馬思媛，胡宇峰，張婧秋，王慧楠，陳夢(mèng)雨，劉芊芊，王英姿

AHP-熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選黃精酒制工藝及其炮制前后藥效對(duì)比研究

石雙慧，王夢(mèng)琳，魏曉彤，馬思媛，胡宇峰，張婧秋，王慧楠，陳夢(mèng)雨，劉芊芊，王英姿*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

優(yōu)化酒黃精wine-processed的高壓蒸制工藝，確定最佳工藝參數(shù)，并對(duì)酒制前后刺激性、免疫調(diào)節(jié)及降血糖作用進(jìn)行研究。以潤(rùn)制時(shí)間、蒸制壓力、蒸制時(shí)間和燜制時(shí)間作為考察因素，以性狀、黃精多糖、薯蕷皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）作為考察指標(biāo)，運(yùn)用AHP-熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）確定酒黃精炮制工藝條件參數(shù)。通過家兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)黃精酒制前后的刺激性作用。通過ip環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，比較黃精酒制前后對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用的影響。通過飼喂高脂高糖飼料、ip鏈脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型，比較黃精酒制前后對(duì)降血糖作用的影響。酒黃精炮制最佳工藝參數(shù)為潤(rùn)制時(shí)間5 h、蒸制時(shí)間1 h、蒸制壓力0.06 MPa、燜制時(shí)間7 h。藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生黃精具有刺激性，黃精酒制后對(duì)黏膜的刺激作用減弱，酒黃精提高小鼠免疫力和降血糖的作用均強(qiáng)于生黃精。優(yōu)選出的酒黃精炮制工藝穩(wěn)定、合理、可行，按照此工藝制備的酒黃精，可以降低其刺激性，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用和降血糖作用，為黃精的炮制工藝研究和臨床用藥提供參考。

AHP-熵權(quán)法；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；酒黃精；炮制工藝；刺激性；免疫調(diào)節(jié)；降血糖作用；薯蕷皂苷元；5-羥甲基糠醛

黃精為百合科黃精屬植物滇黃精Coll. et Hemsl.、黃精Red.或多花黃精Hua的干燥根莖，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎的功效[1]。黃精生品直接服用刺人咽喉，酒制可去除其刺激性，增強(qiáng)補(bǔ)脾潤(rùn)肺、益腎的功效[2-5]?！吨袊?guó)藥典》2020年版黃精項(xiàng)下收錄了酒黃精飲片，但對(duì)于其具體炮制參數(shù)描述均較為籠統(tǒng)，而且目前各地炮制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于酒黃精的炮制工藝不統(tǒng)一，影響臨床療效，因此，建立符合《中國(guó)藥典》規(guī)范及臨床要求的酒黃精飲片的炮制工藝非常必要。

現(xiàn)代研究表明，與常壓蒸制相比，酒黃精高壓蒸制不僅便于控制溫度、時(shí)間等影響因素，極大地縮短炮制時(shí)間，同時(shí)還可以減少活性成分的流失，增強(qiáng)療效[6-8]。多糖在黃精中含量最高，是《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的評(píng)價(jià)黃精質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是黃精發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用最重要最主要的功能性成分。皂苷是黃精中另一主要藥效成分，目前，對(duì)皂苷類成分的研究主要集中于薯蕷皂苷元[9-12]。5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）是黃精炮制過程中的副產(chǎn)物，既有藥理活性又有毒理性[13-16]。黃精炮制后的外觀性狀常作為傳統(tǒng)鑒別手段，浸出物體現(xiàn)了藥材整體含量水平。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酒黃精的炮制工藝研究過程中，以湖南產(chǎn)多花黃精為研究對(duì)象，選擇性狀、黃精多糖、薯蕷皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF為質(zhì)量控制指標(biāo)，首先采用單因素法優(yōu)選酒黃精飲片炮制工藝，再采用層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）優(yōu)選多花黃精高壓蒸制工藝參數(shù)并進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)黃精酒制前后的刺激性、免疫調(diào)節(jié)作用和降血糖作用進(jìn)行研究，為建立穩(wěn)定可控的酒黃精飲片炮制工藝提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSI10S型萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YX-280D型數(shù)顯手提式滅菌器，容積18 L，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；QM-Q5-Y30DW型電蒸鍋，長(zhǎng)沙市全民電器有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京北方利輝實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；756PC型紫外-可見分光光度計(jì)，舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HW.SY21-KP6型智能恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；ZN-02型粉碎機(jī)，北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；A015型多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices；XN-1000V[B1]型血液系統(tǒng)分析儀，德國(guó)賽多利斯（北京）儀器有限公司；ACCU-CHEK型血糖儀，德國(guó)Roche公司；AU680型自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 材料

黃精藥材，批號(hào)2020042401，購(gòu)于新邵南陌生物科技有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定，植物基原為百合科黃精屬植物多花黃精Hua的干燥根莖，驗(yàn)證試驗(yàn)3批藥材批號(hào)分別為2020042402、2020042403、2020042404。黃酒，批號(hào)20180812，酒精度≥15.5% vol，購(gòu)自會(huì)稽山紹興酒股份有限公司。

對(duì)照品薯蕷皂苷元（批號(hào)C10J9Q52616，HPLC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、無水葡萄糖（批號(hào)S22J12H137237，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、5-HMF（批號(hào)Z25N8B49010，HPLC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）及試劑環(huán)磷酰胺（批號(hào)X13J11Y115691）、鹽酸左旋咪唑（批號(hào)Y23M9C56327）、印度墨水（批號(hào)L17S11G124902）、鏈脲佐菌素（批號(hào)S17049）、二甲雙胍（批號(hào)B15A11D121557）、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（批號(hào)S30GR162949），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。氯化鈉注射液，批號(hào)2007091901，購(gòu)自石家莊四藥有限公司。無水碳酸鈉（批號(hào)20191019）、鹽酸（批號(hào)20190426），均分析純，購(gòu)自北京化工廠。乙腈（批號(hào)164793）、甲醇（批號(hào)165503），均為色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 動(dòng)物

健康雄性新西蘭兔6只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（京）2017-0005，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。SPF級(jí)健康BALB/c系小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自斯貝福北京動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（京）2020-0033，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。SPF級(jí)健康雄性C57BL/6系小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自斯貝福北京動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（京）2020-0033。本研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-2022092704-3106。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒黃精炮制工藝

取100 g黃精原藥材，加20 g黃酒拌勻（黃酒用量按照《中國(guó)藥典》2020年版[1]黃精項(xiàng)下酒黃精飲片，“每100 kg黃精，用黃酒20 kg”），潤(rùn)制一定時(shí)間，置于高壓滅菌器中在一定蒸制壓力下蒸制一定時(shí)間后，常壓燜制一定時(shí)間，稍晾，切厚片（2～4 mm），60 ℃鼓風(fēng)干燥，即得酒黃精飲片。

2.2 黃精多糖含量測(cè)定

依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版一部黃精項(xiàng)下黃精多糖測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[1]。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對(duì)照品適量，加水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.33 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取黃精不同炮制品細(xì)粉0.25 g，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘?jiān)盀V紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次，每次10 mL，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，各加水至2.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，測(cè)定待測(cè)溶液的吸光度（）值。以值為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到無水葡萄糖對(duì)照品線性回歸方程為＝0.007 5＋0.045 7，2＝0.999 5。結(jié)果表明，無水葡萄糖在16.50～99.20 μg/mL與值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 樣品測(cè)定 精密稱取黃精不同炮制品粉末，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中多糖含量。

2.3 薯蕷皂苷元的含量測(cè)定[17-21]

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.41 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取過4號(hào)篩的黃精不同炮制品粉末2 g，置于錐形瓶中，加50 mL無水乙醇，稱定質(zhì)量，水浴回流提取4 h，放置室溫后再次稱定質(zhì)量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液20 mL，旋干，殘?jiān)? mol/L的鹽酸溶液80 mL，沸水浴水解4 h，冷卻后分別用20、10、10 mL石油醚萃取3次，合并萃取液，加20 mL水洗滌2次，減壓濃縮后留取殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜? mL量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為GL Science Incnsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（94∶6）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取“2.3.1”項(xiàng)下薯蕷皂苷元對(duì)照品，稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的系列對(duì)照品溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得薯蕷皂苷元線性回歸方程為＝3.738 4＋23.256 0，2＝0.999 3，結(jié)果表明薯蕷皂苷元在1.71～16.80 μg/mL與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度考察 取“2.3.1”項(xiàng)下薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD值為0.75%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性考察 精密稱定BBD-RSM試驗(yàn)第19號(hào)酒黃精樣品粉末6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算薯蕷皂苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為2.10%，重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 精密稱定BBD-RSM試驗(yàn)第19號(hào)酒黃精樣品粉末，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD值為1.81%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)具備良好的穩(wěn)定性。

2.3.8 加樣回收率考察 取已測(cè)知薯蕷皂苷元含量的BBD-RSM試驗(yàn)第19號(hào)酒黃精樣品粉末，精密稱定，共6份，根據(jù)樣品中薯蕷皂苷元的含量，按1∶1的比例加入薯蕷皂苷元對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，制備6份供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均加樣回收率為98.45%，RSD值為2.42%，表明該方法加樣回收率符合規(guī)定。

2.3.9 樣品測(cè)定 精密稱取黃精不同炮制品粉末，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各樣品中薯蕷皂苷元的含量。

2.4 5-HMF的含量測(cè)定[22-24]

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取5-HMF對(duì)照品適量，用50%甲醇溶解并稀釋，制得質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取過3號(hào)篩的黃精不同炮制品粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，在100 W、50 kHz的超聲條件下提取25 min，取出放涼，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖2。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的系列對(duì)照品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，所得線性回歸方程為＝1 220.68－1.50，2＝0.999 4，結(jié)果表明5-HMF在0.02～0.40 mg/mL內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖2 5-HMF對(duì)照品(A)及酒黃精樣品(BBD-RSM試驗(yàn)第19號(hào), B)的HPLC圖

2.4.5 精密度考察 取“2.4.1”項(xiàng)下的5-HMF對(duì)照品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定5-HMF峰面積，計(jì)算得其RSD值為1.63%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性考察 精密稱定BBD-RSM試驗(yàn)第19號(hào)酒黃精樣品粉末6份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算得5-HMF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為1.61%，色譜條件重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 精密稱定BBD-RSM試驗(yàn)第19號(hào)酒黃精樣品粉末，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD值為1.65%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收率考察 取已測(cè)知5-HMF含量的BBD-RSM試驗(yàn)第19號(hào)酒黃精樣品，精密稱定，共6份，根據(jù)樣品中5-HMF的含量，按1∶1的比例加入5-HMF對(duì)照品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，制備6份供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得5-HMF的平均加樣回收率為98.770%，RSD值為1.82%，方法加樣回收率良好。

2.4.9 樣品測(cè)定 精密稱取黃精不同炮制品粉末，按照“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各樣品中5-HMF的含量。

2.5 浸出物的含量測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》2020年版[1]浸出物測(cè)定法（通則2201）中的熱浸法，測(cè)定水溶性浸出物及醇溶性浸出物含量。

2.6 酒黃精炮制工藝的單因素試驗(yàn)

酒制法是黃精的傳統(tǒng)炮制方法，也是現(xiàn)行藥典中規(guī)定的炮制方法?！吨袊?guó)藥典》2020年版收載的酒黃精炮制方法為“每100 kg黃精，用黃酒20 kg，照酒燉法或酒蒸法燉透或蒸透，稍晾，切厚片，干燥”[1]，但具體參數(shù)缺乏量化指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，潤(rùn)制時(shí)間、蒸制壓力、蒸制時(shí)間、燜制時(shí)間等因素均對(duì)酒黃精的質(zhì)量產(chǎn)生一定影響[5-7,25]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇潤(rùn)制時(shí)間、蒸制壓力、蒸制時(shí)間、燜制時(shí)間作為酒黃精炮制工藝的考察因素，以酒黃精性狀以及黃精多糖、薯蕷皂苷元、水溶性浸出物、醇溶性浸出物和5-HMF含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素考察研究。

2.6.1 不同潤(rùn)制時(shí)間考察 稱取黃精原藥材4份，每份100 g，在20%的加黃酒量下分別潤(rùn)制3、4、5、6 h，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在0.04 MPa壓力下，蒸制2 h，燜制8 h。按照《中國(guó)藥典》2020年版酒黃精飲片性狀項(xiàng)下規(guī)定：“表面棕褐色至黑色，有光澤，中心棕色至淺褐色，可見筋脈小點(diǎn)，質(zhì)較柔軟。味甜，微有酒香氣”[1]，進(jìn)行性狀鑒別，并依次測(cè)定黃精多糖、薯蕷皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，結(jié)果見表1。潤(rùn)制時(shí)間為4 h時(shí)，酒黃精飲片性狀與《中國(guó)藥典》2020年版描述一致，黃精多糖、薯蕷皂苷元含量最高，因此，在進(jìn)行后續(xù)BBD-RSM設(shè)計(jì)時(shí)，選擇4 h作為潤(rùn)制時(shí)間的中心點(diǎn)。

表1 不同潤(rùn)制時(shí)間對(duì)酒黃精性狀和評(píng)價(jià)指標(biāo)含量的影響(, n = 3)

2.6.2 不同蒸制壓力考察 稱取黃精原藥材4份，每份100 g，在20%的加黃酒量下潤(rùn)制4 h，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，分別在0.02、0.04、0.06、0.08 MPa壓力下，蒸制2 h，燜制8 h，進(jìn)行性狀鑒別，并依次測(cè)定黃精多糖、薯蕷皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，結(jié)果見表2。蒸制壓力為0.04 MPa時(shí)，酒黃精飲片性狀與《中國(guó)藥典》2020年版描述一致，黃精多糖最高，薯蕷皂苷元、醇浸出物和水浸出物較高。因此，在進(jìn)行后續(xù)BBD-RSM設(shè)計(jì)時(shí)，選擇0.04 MPa作為蒸制壓力的中心點(diǎn)。

2.6.3 不同蒸制時(shí)間考察 稱取黃精原藥材4份，每份100 g，在20%的加黃酒量下潤(rùn)制4 h，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在0.04 MPa壓力下，分別蒸制1、2、3、4 h，燜制8 h，進(jìn)行性狀鑒別，并依次測(cè)定黃精多糖、薯蕷皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，結(jié)果見表3。蒸制時(shí)間為2 h時(shí)，酒黃精飲片性狀與《中國(guó)藥典》2020年版描述一致，薯蕷皂苷元、水浸出物最高，黃精多糖、醇浸出物較高。因此，選擇2 h為后續(xù)BBD-RSM設(shè)計(jì)中蒸制時(shí)間的中心點(diǎn)。

2.6.4 燜制時(shí)間考察 稱取黃精原藥材4份，每份100 g，在20%的加黃酒量下潤(rùn)制4 h，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在0.04 MPa壓力下，蒸制2 h，分別燜制7、8、9、10 h，進(jìn)行性狀鑒別，并依次測(cè)定黃精多糖、薯蕷皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，燜制時(shí)間為8 h時(shí)，酒黃精飲片性狀與《中國(guó)藥典》2020年版描述一致，黃精多糖、醇浸出物含量最高，水浸出物和薯蕷皂苷元較高。因此，選擇8 h為后續(xù)BBD-RSM設(shè)計(jì)中燜制時(shí)間的中心點(diǎn)。

表2 不同蒸制壓力對(duì)酒黃精性狀和評(píng)價(jià)指標(biāo)含量的影響(, n = 3)

表3 不同蒸制時(shí)間對(duì)酒黃精性狀和評(píng)價(jià)指標(biāo)含量的影響(, n = 3)

2.7 基于AHP-熵權(quán)法結(jié)合BBD-RSM法優(yōu)化酒黃精炮制工藝

2.7.1 AHP法計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)[26-27]本實(shí)驗(yàn)以黃精多糖、醇溶性浸出物、水溶性浸出物、5-HMF、薯蕷皂苷元含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)影響酒黃精指標(biāo)間的相互關(guān)系及重要程度，確定各指標(biāo)先后順序：黃精多糖＞醇浸出物＝水浸出物＞5-HMF＞薯蕷皂苷元。采用1-9標(biāo)度法構(gòu)成評(píng)價(jià)指標(biāo)兩兩比較的優(yōu)先矩陣，并計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)（W1），結(jié)果見表5。

2.7.2 AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合權(quán)重[26,28-29]根據(jù)熵權(quán)法公式計(jì)算權(quán)重系數(shù)（W2），醇浸出物、水浸出物、黃精多糖、薯蕷皂苷元、5-HMF的權(quán)重系數(shù)W2分別為0.131 7、0.152 4、0.175 0、0.374 9、0.166 0。根據(jù)公式計(jì)算復(fù)合權(quán)重W，醇浸出物、水浸出物、黃精多糖、薯蕷皂苷元、5-HMF的復(fù)合權(quán)重W依次為0.156 3、0.181 0、0.415 7、0.148 4、0.098 6。

表4 不同燜制時(shí)間對(duì)酒黃精性狀和評(píng)價(jià)指標(biāo)含量的影響(, n = 3)

表5 指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣

Table 5 Decision matrix of paired comparison on indexes

權(quán)重指標(biāo)醇浸出物水浸出物黃精多糖薯蕷皂苷元5-HMFWj1 醇浸出物111/2320.21 水浸出物111/2320.21 黃精多糖221640.41 薯蕷皂苷元1/31/31/612/30.07 5-HMF1/21/21/43/210.10

2.7.3 綜合評(píng)分計(jì)算[26,30-31]按公式計(jì)算酒黃精各指標(biāo)成分的綜合評(píng)分。

X為各指標(biāo)含量，Xmax為各指標(biāo)含量最大值

2.7.4 BBD-RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，選擇潤(rùn)制時(shí)間（1）、蒸制時(shí)間（2）、蒸制壓力（3）和燜制時(shí)間（4）4個(gè)因素為自變量，以黃精多糖、薯蕷皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量綜合評(píng)分為因變量，采用4因素3水平的BBD-RSM設(shè)計(jì)方法，考察各因素對(duì)酒黃精炮制工藝的影響。每個(gè)因素設(shè)置高、中、低3個(gè)水平，分別記作?1、0、+1，利用Design-Expert 11軟件進(jìn)行多元回歸擬合，BBD-RSM因素水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表6 BBD-RSM因素水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 6 Level of factors, test design and results of BBD-RSM

序號(hào)X1/hX2/hX3/MPaX4/h醇浸出物/%水浸出物/%黃精多糖/(mg?g?1)薯蕷皂苷元/(μg?g?1)5-HMF/(mg?g?1)綜合評(píng)分 15 (+1)2 (0)0.04 (0)9 (+1)62.3961.7226.2518.601.0355.18 24 (0)3 (+1)0.04 (0)7 (?1)70.3067.9518.7718.301.4156.09 33 (?1)1 (?1)0.04 (0)8 (0)67.5066.4938.539.780.5057.37 45 (+1)3 (+1)0.04 (0)8 (0)68.3966.4842.7510.130.3358.78 54 (0)2 (0)0.02 (?1)9 (+1)62.3758.5947.5116.140.3760.76 64 (0)1 (?1)0.04 (0)9 (+1)59.2157.1650.8416.050.4161.61 74 (0)2 (0)0.06 (+1)9 (+1)62.0360.1746.8015.680.5261.63 85 (+1)2 (0)0.02 (?1)8 (0)53.4755.5751.8915.121.0661.93 94 (0)3 (+1)0.06 (+1)8 (0)55.9254.1653.2414.720.8761.94 104 (0)1 (?1)0.02 (?1)8 (0)67.6663.2747.1213.630.4062.00 113 (?1)2 (0)0.04 (0)7 (?1)62.0561.4136.8216.442.4763.22 125 (+1)2 (0)0.06 (+1)8 (0)59.6060.6549.6217.090.6363.22 133 (?1)2 (0)0.04 (0)9 (+1)44.7449.2163.2115.081.1163.74 145 (+1)2 (0)0.04 (0)7 (?1)60.9859.7048.1715.421.6665.01 154 (0)2 (0)0.02 (?1)7 (?1)64.0063.0760.2810.690.3965.82 163 (?1)2 (0)0.06 (+1)8 (0)59.4866.3865.149.410.3267.06 174 (0)3 (+1)0.04 (0)9 (+1)66.8469.0050.2524.690.6571.26 184 (0)2 (0)0.06 (+1)7 (?1)65.6463.2370.788.671.0172.05 194 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)56.5058.3061.4619.402.0172.82 205 (+1)1 (?1)0.04 (0)8 (0)63.3660.9060.7321.601.0272.88 213 (?1)3 (+1)0.04 (0)8 (0)56.1858.7061.2019.592.0273.27 223 (?1)2 (0)0.02 (?1)8 (0)56.0858.2861.2020.522.0073.57 234 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)67.5765.4955.9228.890.1573.72 244 (0)1 (?1)0.06 (+1)8 (0)55.5560.8460.8420.612.0774.19 254 (0)3 (+1)0.02 (?1)8 (0)56.0859.2861.0921.592.0474.41 264 (0)1 (?1)0.04 (0)7 (?1)65.4966.1372.4116.650.5076.02 274 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)59.2956.8865.2415.053.1276.31 284 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)66.7566.1075.7510.231.0976.40 294 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)64.9163.1288.4921.491.1386.68

2.7.5 模型擬合 采用Design Expert 11軟件對(duì)比各模型擬合參數(shù)，建立醇浸出物、水浸出物、黃精多糖、薯蕷皂苷元和5-HMF的綜合評(píng)分（）對(duì)潤(rùn)制時(shí)間（1）、蒸制時(shí)間（2）、蒸制壓力（3）和燜制時(shí)間（4）的二次回歸模型方程：＝77.19－1.771－0.692＋0.133－2.004－7.5012＋1.9513－2.5914－6.1723＋7.3924－1.3434－7.2312－4.1622－4.3132－7.5942，二項(xiàng)式擬合方程的2＝0.852 1，＝0.001 2＜0.01，失擬項(xiàng)＝0.902 2＞0.05，表明二次多項(xiàng)式回歸模型擬合度較高，可靠性較強(qiáng)。因此，選用該模型對(duì)酒黃精炮制工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析具有一定的合理性和可行性。該回歸模型中12、23、24、12、42項(xiàng)的＜0.01，表明因素1與因素4對(duì)綜合評(píng)分的線性效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因素2與因素1、3、4之間均有顯著的交互作用。結(jié)果見表7。

2.7.6 最佳工藝條件的預(yù)測(cè) 采用Design-Expert 11軟件，根據(jù)擬合方程預(yù)測(cè)酒黃精炮制工藝的最佳條件，同時(shí)繪制1、2、3、4對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面圖，具體見圖3。以綜合評(píng)分最大值為優(yōu)化目標(biāo)，預(yù)測(cè)的最優(yōu)炮制工藝為潤(rùn)制時(shí)間4.68 h、蒸制時(shí)間1 h、蒸制壓力0.06 MPa、燜制時(shí)間7.18 h，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定酒黃精最佳炮制工藝為潤(rùn)制時(shí)間5 h、蒸制時(shí)間1 h、蒸制壓力0.06 MPa、燜制時(shí)間7 h。

表7 二次多項(xiàng)式方程模型方差分析

Table 7 Variance analysis of quadratic polynomial equation model

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性 回歸模型1 378.781498.495.760.00極顯著X3X47.1717.170.420.53 X137.60137.602.200.16 X12339.281339.2819.850.00 X25.7715.770.340.57 X22112.091112.096.560.02 X30.2210.220.010.91 X32120.581120.587.050.02 X448.07148.072.810.12 X42373.321373.3221.840.00 X1X2224.981224.9813.160.00 剩余239.291417.09 X1X315.21115.210.890.36 失擬項(xiàng)116.571011.660.380.90不顯著 X1X426.77126.771.570.23 誤差122.72430.68 X2X3152.161152.168.900.01 總和1 618.1028 X2X4218.631218.6312.790.00

圖3 各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖

2.7.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)選出的酒黃精最佳炮制工藝，每100克黃精原藥材，加20 g黃酒拌勻，潤(rùn)制5 h，置于高壓滅菌器中在0.06 MPa蒸制壓力下蒸制1 h后，常壓燜制7 h，稍晾，切厚片（2～4 mm），60 ℃鼓風(fēng)干燥，炮制3批酒黃精飲片，測(cè)定醇浸出物、水浸出物、黃精多糖、薯蕷皂苷元和5-HMF的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8，可知，3批酒黃精飲片的綜合評(píng)分分別為82.00、82.91、83.76，平均綜合評(píng)分為82.89，RSD＝1.06%，預(yù)測(cè)值為82.73，即綜合評(píng)分實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的偏差控制在±3%以內(nèi)，說明酒黃精炮制工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化具有一定的穩(wěn)定性和可靠性，能制備出品質(zhì)優(yōu)良、質(zhì)量穩(wěn)定可控的酒黃精飲片。

2.8 黃精酒制前后刺激性比較

2.8.1 供試藥物制備方法 取生黃精飲片適量，加10倍體積的蒸餾水回流提取3次，每次1 h，趁熱濾過，將濾液合并濃縮至1.0 g/mL，給藥前用蒸餾水稀釋到所需質(zhì)量濃度，即得生黃精提取液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∽罴雅谥乒に囍苽涞木泣S精飲片適量，按上述方法制備即得酒黃精提取液。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

Table 8 Validation of experimental results

序號(hào)醇浸出物/%水浸出物/%黃精多糖/(mg?g?1)薯蕷皂苷元/(μg?g?1)5-HMF/(mg?g?1)綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值偏差/%RSD/% 162.6061.6080.5623.670.3182.0082.73?0.891.06 263.5063.7580.7722.930.3882.91 0.21 364.0261.3280.2122.750.6583.76 1.24

2.8.2 分組與給藥 取雄性新西蘭兔6只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，給藥前檢查家兔雙眼角膜、虹膜及結(jié)膜的情況，如有病變者剔除不用。分別取“2.8.1”項(xiàng)下生黃精和酒黃精提取液的稀釋液（0.5 g/mL）0.1 mL，采用自身對(duì)照法，將提取液滴入一側(cè)兔眼結(jié)膜囊內(nèi)，作用時(shí)間10 s，2 min后立即取生理鹽水沖洗，另一側(cè)兔眼滴加等量生理鹽水作為對(duì)照，觀察記錄兔眼角膜、虹膜、結(jié)膜等局部反應(yīng)及恢復(fù)情況，按照Draize評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷生黃精和酒黃精提取液對(duì)兔眼的刺激[32-33]。

2.8.3 結(jié)果 生黃精提取液和酒黃精提取液對(duì)兔眼的刺激強(qiáng)度評(píng)分結(jié)果見圖4，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，生黃精組對(duì)兔眼的刺激性作用較明顯，主要表現(xiàn)為血管充血，虹膜和角膜部位均出現(xiàn)炎癥、水腫現(xiàn)象。酒黃精組均未見明顯結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫、虹膜損害和角膜損害等現(xiàn)象，各組均未見其他毒性反應(yīng)。

圖4 家兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 黃精酒制前后對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用影響研究

2.9.1 供試藥物制備方法 提取液的制備同“2.8.1”項(xiàng)下方法。

2.9.2 動(dòng)物分組及給藥處理方法 取BALB/c系小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和生黃精低、中、高劑量組及酒黃精低、中、高劑量組，每組6只。按照小鼠與成人體表面積換算方法進(jìn)行劑量換算[34-35]，設(shè)置生黃精和酒黃精低、中、高3個(gè)劑量組，劑量分別為2.5、5.0、10.0 g/kg。除空白組注射生理鹽水外，其余組均ip 80 mg/kg環(huán)磷酰胺3 d，建立小鼠免疫抑制模型。造模完成后，空白組和模型組ig生理鹽水，陽性藥組ig劑量40 mg/kg的鹽酸左旋咪唑，給藥組按照不同的劑量ig，每日1次，連續(xù)20 d。

2.9.3 臟器指數(shù)測(cè)定[36-37]將各組小鼠處死并解剖，取出脾臟和胸腺，用生理鹽水清洗并用濾紙將表面血跡吸干，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量，分別計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量

胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量

黃精酒制前后對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響見表9。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著降低（＜0.01），結(jié)合模型對(duì)照組小鼠的行為表現(xiàn)及相關(guān)形態(tài)，說明實(shí)驗(yàn)已成功構(gòu)建小鼠免疫抑制模型。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯升高（＜0.01）。不同劑量的生黃精、酒黃精組的胸腺指數(shù)呈劑量相關(guān)性升高，其中酒黃精中、高劑量組還能顯著升高胸腺和脾臟指數(shù)（＜0.01）。同時(shí)，酒黃精低、中劑量組與生黃精低、中劑量組相比，脾臟指數(shù)具有顯著性差異（＜0.05）。綜上所述，生黃精組和酒黃精組均可提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，且提高效果隨著給藥濃度的增加而增強(qiáng)，同等給藥劑量，酒黃精組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于生黃精組，提示酒黃精可明顯提高動(dòng)物免疫器官功能水平，且效果優(yōu)于生黃精。

表9 小鼠免疫臟器指數(shù)(, n = 6)

與空白對(duì)照組比較：**＜0.01；與模型對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與生黃精同等給藥劑量組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01，下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group;▲< 0.05▲▲< 0.01equal dosage group of, same as below tables

2.9.4 外周血細(xì)胞測(cè)定[38-39]眼眶取血，精密移取20 μL，用血液分析儀測(cè)定全血紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）值。黃精酒制前后對(duì)免疫抑制小鼠外周血細(xì)胞的影響見表10。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠WBC、RBC、HGB和PLT均顯著降低（＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組WBC、RBC、HGB和PLT顯著升高（＜0.01）；生黃精低劑量組小鼠WBC、RBC顯著升高（＜0.01）；生黃精中劑量組WBC、RBC、PLT顯著升高（＜0.01）；生黃精高劑量組WBC、RBC、HGB和PLT均顯著升高（＜0.01、0.05）；酒黃精低劑量組WBC、RBC和HGB顯著升高（＜0.05、0.01）；酒黃精中、高劑量組WBC、RBC、HGB和PLT均顯著升高（＜0.01、0.05）。同時(shí)，酒黃精低、中、高劑量組與生黃精低、中、高劑量組相比較WBC、HGB有顯著性差異（＜0.05）。以上結(jié)論提示酒黃精可明顯增加免疫抑制模型小鼠的外周血細(xì)胞，且效果優(yōu)于生黃精。

2.9.5 碳廓清試驗(yàn) 于最后一次給藥1 h后，將印度墨汁（按1∶3體積比加生理鹽水稀釋）注入小鼠尾靜脈[40]，分別于注射后2 min和10 min，用采血毛細(xì)管從眼內(nèi)眥靜脈叢取20 μL血樣加入配制好的2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。選擇Na2CO3溶液作為空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀在600 nm處檢測(cè)值[41]。不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定值記作1、2，處死小鼠，解剖取出肝臟和脾臟并稱定質(zhì)量，按公式計(jì)算碳廓清指數(shù)（）和吞噬指數(shù)（）[42]。

表10 小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)(, n = 6)

＝(lg1－lg2)/(2－1)

＝體質(zhì)量/(肝質(zhì)量＋脾質(zhì)量)×1/3

黃精酒制前后對(duì)免疫抑制小鼠碳粒廓清功能的影響見表11。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠和均顯著降低（＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組小鼠和均顯著升高（＜0.05、0.01）。生黃精低、中劑量組均顯著升高（＜0.05、0.01），高劑量組和均顯著升高（＜0.01）；酒黃精不同劑量組均能使和顯著升高（＜0.01）。同時(shí)，酒黃精低、中、高劑量組與生黃精低、中、高劑量組相比較，、有顯著性差異（＜0.01）。綜上所述，與模型對(duì)照組比較，不同劑量的生黃精組和酒黃精組小鼠的、均有升高，其中酒黃精可明顯提高免疫抑制小鼠的碳粒廓清功能，且效果優(yōu)于生黃精。

表11 小鼠碳K和α(, n = 6)

2.10 黃精酒制前后對(duì)降血糖作用影響研究

2.10.1 供試藥物制備方法 提取液的制備同“2.8.1”項(xiàng)下方法。

2.10.2 動(dòng)物分組及給藥處理方法 C57BL/6系小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將小鼠分為空白對(duì)照組和造模組，空白對(duì)照組飲食正常，造模組飼喂高脂高糖飼料，連續(xù)給藥30 d，禁食12 h后，造模組ip 70 mg/kg劑量1%鏈脲佐菌素（溶于pH 4.4，0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用），72 h后，斷尾取血測(cè)定空腹血糖≥11.1 mmol/L視為造模成功小鼠，將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和生黃精低、中、高劑量組及酒黃精低、中、高劑量組?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組均ig生理鹽水，陽性藥組按200 mg/kg劑量ig二甲雙胍，生黃精和酒黃精低、中、高劑量組按照不同的劑量ig，每日1次，連續(xù)30 d。

2.10.3 小鼠血糖測(cè)定 給藥結(jié)束后，小鼠采用剪尾的方式取血，利用血糖測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定試紙插入儀器中，試紙自然吸入血樣，穩(wěn)定后讀取數(shù)值。黃精酒制前后對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響見表12。與空白對(duì)照組比較，經(jīng)過高脂飼料聯(lián)合STZ誘導(dǎo)后，模型對(duì)照組小鼠的血糖水平顯著上升（＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、生黃精和酒黃精不同劑量組的血糖水平表現(xiàn)出降低趨勢(shì)（＜0.01、0.05）。

2.10.4 血脂水平測(cè)定[43]眼眶取血，靜置待分層后，離心取血清，采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low- density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

表12 糖尿病小鼠空腹血糖(, n = 6)

黃精酒制前后對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響見表13。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠TC、LDL-C和TG含量均顯著升高（＜0.01），HDL-C含量顯著降低（＜0.01），說明已成功構(gòu)建小鼠糖尿病模型。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組小鼠TC、LDL-C、TG含量顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），HDL-C顯著升高（＜0.01）；同等5 g/(kg?d)給藥劑量，ig生黃精和酒黃精提取液的小鼠TC含量顯著降低（＜0.05、0.01）；同等10 g/(kg?d)給藥劑量，生黃精組小鼠TC、TG含量顯著降低（＜0.05、0.01），酒黃精組小鼠TC、LDL-C和TG含量顯著降低（＜0.01、0.05），HDL-C含量顯著升高（＜0.05）。同時(shí)，與生黃精高劑量組相比，酒黃精高劑量組小鼠TC、LDL-C和TG含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。綜上所述，不同給藥劑量的生黃精、酒黃精提取液均可降低小鼠TC、LDL-C和TG含量，增加HDL-C含量，生黃精和酒黃精提取液對(duì)2型糖尿病小鼠血脂均有一定的改善作用，酒黃精對(duì)血脂改善作用優(yōu)于生黃精。

表13 糖尿病小鼠血脂(, n = 6)

2.10.5 小鼠臟器指數(shù)的測(cè)定[44-45]將各組小鼠處死并解剖，取出脾臟、肝臟和腎臟，用生理鹽水清洗并用濾紙將表面血跡吸干，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量，按照公式計(jì)算臟器指數(shù)。

肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量

腎臟指數(shù)＝腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量

黃精酒制前后對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響見表14。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著升高（＜0.01），說明糖尿病小鼠出現(xiàn)肝臟腫大，腎臟損傷、水腫，脾臟體積增大等現(xiàn)象。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組的臟器指數(shù)均顯著降低（＜0.01）；生黃精高劑量組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著降低（＜0.05）；酒黃精中劑量組能顯著降低肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)（＜0.05、0.01），高劑量組腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著降低（＜0.01）。

給藥劑量為5 g/(kg?d)，酒黃精與生黃精肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)有顯著性差異（＜0.05）；給藥劑量為10 g/(kg?d)，黃精酒制前后脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)有顯著性差異（＜0.05），肝臟指數(shù)無顯著性差異。綜上所述，生黃精和酒黃精對(duì)臟器指數(shù)均有一定的調(diào)節(jié)作用，酒黃精對(duì)胸腺、腎臟和脾臟損傷的抑制作用優(yōu)于生黃精組。

表14 糖尿病小鼠臟器指數(shù)(, n = 6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用AHP-熵權(quán)法結(jié)合BBD-RSM優(yōu)化酒黃精炮制工藝參數(shù)，可同時(shí)兼具決策人的主觀判斷和待評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)的客觀信息[46]，提高了數(shù)據(jù)的合理性和工藝參數(shù)的科學(xué)性，可以比較準(zhǔn)確地從藥效物質(zhì)的角度更加公正地評(píng)價(jià)酒黃精工藝的相關(guān)參數(shù)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在潤(rùn)制時(shí)間5 h、蒸制時(shí)間1 h、蒸制壓力0.06 MPa、悶潤(rùn)時(shí)間7 h的工藝條件下，酒黃精的指標(biāo)成分黃精多糖、薯蕷皂苷元、醇浸出物、水浸出物、5-HMF的平均綜合評(píng)分為82.89，與模型理論預(yù)測(cè)值基本一致，表明該模型準(zhǔn)確性高，制備的酒黃精飲片質(zhì)量穩(wěn)定，能夠較合理地應(yīng)用于酒黃精炮制工藝的優(yōu)化，本研究?jī)?yōu)化的酒黃精炮制工藝只是小試結(jié)果，最終的生產(chǎn)工藝仍需要進(jìn)行中試放大試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

黃精生品刺人咽喉，炮制后刺激性減弱，同時(shí)能夠增強(qiáng)補(bǔ)脾潤(rùn)肺、益腎的作用。在炮制減毒方面，本研究利用兔眼刺激性試驗(yàn)比較了黃精酒制前后刺激性作用，結(jié)果表明，生黃精具有刺激性，酒制后刺激性減弱。有文獻(xiàn)認(rèn)為黏液質(zhì)是黃精刺激性成分，炮制后黏液質(zhì)被大量破壞，從而減輕對(duì)咽喉的刺激性[47-48]；也有報(bào)道炮制后正己醛、莰烯等揮發(fā)性成分含量減少，可能是黃精的刺激性成分[49]，但以上均是推測(cè)，缺少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)。胡菊[14]利用家兔眼刺激性和皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)篩選出黃精刺激性成分認(rèn)為可能為黃精針晶，其實(shí)驗(yàn)所用的黃精生品由滇黃精鮮品60 ℃干燥制得，但由于黃精傳統(tǒng)加工方法為“黃精鮮品-去雜-洗凈-蒸煮-干燥-黃精生品”[50-52]，蒸煮后再干燥的黃精生品是否具有刺激性有待深入研究。

在炮制增效方面，本研究采用ip環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，運(yùn)用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素構(gòu)建2型糖尿病小鼠模型，比較黃精酒制前后免疫調(diào)節(jié)和降血糖作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃精酒制后可以增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)和降血糖作用。目前，黃精的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究多集中于黃精多糖，《中國(guó)藥典》2020年版[1]也以多糖作為黃精的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。由于黃精在炮制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，以及多糖發(fā)生了水解反應(yīng)，炮制后多糖含量降低，寡糖和單糖含量升高[53]，并產(chǎn)生了5-HMF，因此僅以多糖作為質(zhì)量控制指標(biāo)并不能完全反映黃精炮制前后的藥效差異。寡糖作為糖類研究的重要組成部分，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃精酒制后多糖含量降低，寡糖含量升高，楊云等[54]研究發(fā)現(xiàn)黃精寡糖具有促進(jìn)小鼠非特異性免疫的作用，可增強(qiáng)小鼠體液免疫功能，因此有必要對(duì)黃精炮制前后寡糖的成分變化和藥效進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步闡明黃精炮制增效的科學(xué)內(nèi)涵提供研究基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 319-320.

[2] 李晶晶, 王洪軍, 孟德玉, 等. 黃精炮制的歷史沿革研究 [J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 59(S1): 171-173.

[3] 戴萬生, 趙聲蘭, 朱智蕓, 等. 不同輔料蒸制對(duì)滇黃精化學(xué)成分含量的影響 [J]. 云南中醫(yī)中藥雜志, 2015, 36(7): 70-72.

[4] 郭信東, 袁小鳳, 楊昌貴, 等. 黃精酒制后活性成分的變化研究 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2022, 33(6): 1366-1368.

[5] 劉艷艷, 蔣琳, 楊婷宇, 等. 酒黃精現(xiàn)代研究進(jìn)展 [J]. 廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 38(4): 130-134.

[6] 宋藝君, 郭濤, 馬存德, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化制黃精高壓蒸制工藝研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2018, 20(7): 1261-1267.

[7] 張婕, 金傳山, 吳德玲, 等. 正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃精加壓酒蒸工藝研究 [J]. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 33(1): 72-74.

[8] 王永祿, 王麗瑤, 朱欣佚, 等. 常壓蒸制和高壓蒸制對(duì)酒黃精化學(xué)成分的影響研究 [J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2014, 34(8): 173-175.

[9] 姜程曦, 張鐵軍, 陳常青, 等. 黃精的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(1): 1-16.

[10] 陳詩麗, 閔可, 楊蓉, 等. 解吸附電暈束電離質(zhì)譜法快速測(cè)定黃精中的薯蕷皂苷元 [J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 45(5): 136-143.

[11] 王帥, 王麗麗, 房娟娟, 等. 滇黃精酒制過程中顏色與5種成分含量變化的相關(guān)性分析 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2022, 28(21): 156-162.

[12] 鐘凌云, 周燁, 龔千鋒. 炮制對(duì)黃精薯蕷皂苷元影響的研究 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2009, 27(3): 538-540.

[13] 東寶花, 蔣云秀, 強(qiáng)夢(mèng)琴, 等. 黃精炮制沿革及現(xiàn)代研究進(jìn)展 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2022, 40(11): 213-217.

[14] 胡菊. 九蒸九曬黃精炮制“緩性增效”原理及產(chǎn)品開發(fā)研究 [D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué), 2021.

[15] 李瑞. 黃精產(chǎn)地加工—炮制一體化研究[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 2020.

[16] 宋藝君, 郭濤, 周曉程. 不同產(chǎn)地黃精經(jīng)不同方法炮制后多糖、5-羥甲基糠醛的含量變化 [J]. 中國(guó)藥房, 2017, 28(16): 2256-2258.

[17] 焦劼, 陳黎明, 孫瑞澤, 等. 不同產(chǎn)地黃精主要化學(xué)成分比較及主成分分析 [J]. 中藥材, 2016, 39(3): 519-522.

[18] 孫婷婷, 張紅, 李曄, 等. 陜西產(chǎn)黃精不同炮制品中薯蕷皂苷元含量分析 [J]. 中國(guó)藥師, 2017, 20(1): 158-160.

[19] 李帆. 九華黃精遺傳多樣性及HPLC特征圖譜研究 [D].溫州: 溫州大學(xué), 2021.

[20] 馮治國(guó), 趙祺, 朱強(qiáng), 等. 基于熵權(quán)法和灰色關(guān)聯(lián)分析法評(píng)價(jià)安徽省不同產(chǎn)地黃精藥材質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2021, 52(12): 3689-3695.

[21] 劉紹歡, 洪迪清, 王世清. 黔產(chǎn)栽培黃精的薯蕷皂苷元含量測(cè)定 [J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2010, 19(5): 44-45.

[22] 馬佳麗, 蔣殷盈, 蔣福升, 等. 九蒸九制多花黃精炮制過程變化研究 [J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 44(5): 480-485.

[23] 殷海霞, 鄔秋萍, 平欲暉, 等. HPLC法同時(shí)測(cè)定黃精中5-羥基麥芽酚、5-羥甲基糠醛和黃精堿A的含量 [J]. 中國(guó)藥師, 2018, 21(9): 1683-1686.

[24] 王蕾, 張語凡, 王鑫, 等. 生川烏片炮制過程中5-HMF含量隨炮制時(shí)間的變化規(guī)律研究 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2017, 34(3): 17-20.

[25] 劉露梅, 王能, 陳丹, 等. 基于黃精降血糖功效的酒黃精炮制工藝優(yōu)選 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2021, 32(8): 1915-1918.

[26] 楊婷, 黃瑩瑩, 方楊冰, 等. 基于AHP-熵權(quán)法結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選嶺南特色飲片制枳殼的發(fā)酵工藝及發(fā)酵前后成分對(duì)比研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(20): 6443-6450.

[27] 李娟, 李保安, 方晗, 等. 基于AHP-熵權(quán)法的發(fā)明專利價(jià)值評(píng)估: 以豐田開放專利為例 [J]. 情報(bào)雜志, 2020, 39(5): 59-63.

[28] 胡兆流, 陳秋谷, 王佛長(zhǎng), 等. 基于信息熵理論權(quán)重分析的正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選參黛愈瘍灌腸液水提工藝 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2020, 35(3): 442-446.

[29] 王夢(mèng)珂, 王夢(mèng)偉, 李蒙恩, 等. 基于AHP-熵權(quán)法的白附子有效成分與顏色值的相關(guān)性研究 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2022, 40(12): 125-131.

[30] 賈德強(qiáng), 賀成柱, 丁立利. AHP-熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化當(dāng)歸微波真空干燥工藝研究 [J]. 中國(guó)農(nóng)機(jī)化學(xué)報(bào), 2023, 44(2): 60-68.

[31] 王夢(mèng)偉, 王夢(mèng)珂, 李蒙恩, 等. 基于AHP-熵權(quán)法的天南星飲片顏色與有效成分相關(guān)性研究 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2022, 33(11): 2648-2652.

[32] 楊穎. 漢防己堿納米乳滴眼液的制備及其在兔眼的藥代動(dòng)力學(xué)研究 [D]. 鄭州: 鄭州大學(xué), 2021.

[33] 何文, 盧朝薇. 伏立康唑磺丁基醚-β-環(huán)糊精包合物對(duì)兔眼刺激性考察研究 [J]. 中國(guó)藥師, 2019, 22(11): 2035-2037.

[34] 唐穎. 七種免疫增強(qiáng)劑及其復(fù)方對(duì)豬圓環(huán)病毒2型基因工程疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究 [D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2017.

[35] 胡佳莉. 紅曲黃精發(fā)酵工藝及免疫調(diào)節(jié)和降血脂作用研究 [D]. 廣州:廣東藥科大學(xué), 2020.

[36] 譚輝. 紫山藥花青素的提取及口服液的研制 [D]. 成都: 西南交通大學(xué), 2018.

[37] 李澤, 潘登, 沈建利, 等. 黃精多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 藥物生物技術(shù), 2013, 20(3): 241-244.

[38] 龍婷婷. 基于TLR4-MAPK/NF-κB信號(hào)通路探討黃精多糖免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤作用機(jī)制研究 [D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué), 2018.

[39] 劉娜. 黃精多糖的分離、鑒定及免疫調(diào)節(jié)功效研究 [D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 2017.

[40] 方選, 李昇剛, 扆雪濤, 等. 卡馬西平對(duì)小鼠免疫功能的影響 [J]. 中國(guó)藥師, 2011, 14(5): 648-650.

[41] 涂曉慧. 2,4-D降解菌的篩選、鑒定及其降解特性研究 [D].合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[42] 劉懷永. 沙棘籽油軟膠囊功效成分分析及增強(qiáng)免疫功能研究 [D]. 福州: 福建醫(yī)科大學(xué), 2014.

[43] 韓笑, 匡宇, 張舜杰, 等. 黃精、桑葉和玉竹配伍的降血糖藥效學(xué)研究 [J]. 中藥與臨床, 2018, 9(3): 26-29.

[44] 王藝. 黃精、滇黃精多糖的結(jié)構(gòu)表征與降血糖活性分析 [D]. 西安: 陜西師范大學(xué), 2019.

[45] 王韶君. 山茱萸炮制前后對(duì)2型糖尿病小鼠的降血糖作用及機(jī)制研究 [D]. 西安:陜西師范大學(xué), 2016.

[46] 王繼龍, 魏舒暢, 劉永琦, 等. 基于G1-熵權(quán)法和正交設(shè)計(jì)優(yōu)選黃芪百合顆粒的提取純化工藝 [J]. 中草藥, 2018, 49(3): 596-603.

[47] 秦宇雯, 張麗萍, 趙祺, 等. 九蒸九曬黃精炮制工藝的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5631-5637.

[48] 鐘凌云, 龔千鋒, 張的鳳, 等. 黃精炮制研究現(xiàn)狀分析 [J]. 中藥材, 2007, 30(12): 1618-1621.

[49] 王進(jìn), 岳永德, 湯鋒, 等. 氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)黃精炮制前后揮發(fā)性成分的分析 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(16): 2187-2191.

[50] 錢紅月, 董琦, 肖移生. 江西省黃精加工與炮制的現(xiàn)狀與分析 [J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2022, 31(20): 116-118.

[51] 易方, 劉會(huì). 黃精“產(chǎn)地加工-炮制一體化”的藥材及飲片質(zhì)量研究 [J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2021, 37(6): 173-177.

[52] 趙君, 孫樂明, 章啟東. 黃精產(chǎn)地加工與炮制一體化初步研究 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2020, 16(9): 61-63.

[53] Fan B L, Wei G L, Gan X F,.Study on the varied content ofpolysaccharides in the processing of steaming and shining for nine times based on HPLC-MS/MS and chemometrics [J]., 2020, 159: 105352.

[54] 楊云, 王爽, 馮云霞, 等. 黃精中小分子糖對(duì)小鼠免疫功能的影響 [J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(18): 3447-3450.

Optimization of processing technology of wine-processedby combination of Box-Behnken design-response surface method and AHP-entropy weight method and comparison of efficacy before and after processing

SHI Shuang-hui, WANG Meng-lin, WEI Xiao-tong, MA Si-yuan, HU Yu-feng, ZHANG Jing-qiu, WANG Hui- nan, CHEN Meng-yu, LIU Qian-qian, WANG Ying-zi

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To optimize the high-pressure steaming process of wine-processed Huangjing (, PR) (wpPR) and determine the best process parameters, and to study the irritation, immune regulation and hypoglycemic effect before and after wine processing.Taking the moistening time, steaming pressure, steaming time and stewing time as investigation factors and characteristics, polysaccharide, diosgenin, water extract, alcohol extract and 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) as investigation indexes, the AHP-entropy weight method combined with the Box-Behnken design-response surface method (BBD-RSM) were used to determine the processing parameters of wpPR. The irritating effect of PR before and after processing was evaluated by rabbit eye irritation test. The immunosuppressive model of mice was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide, and compared the effects of PR before and after processing on immune regulation. The model of diabetes mice was established by feeding high fat and high sugar diet and intraperitoneal injection of streptozotocin, and the effect of PR before and after processing on hypoglycemic effect was compared.The best processing parameters of wpPR was moistening time of 5 h, steaming time of 1 h, steaming pressure of 0.06 MPa and stewing time of 7 h. The results of the pharmacodynamic experiment showed that raw PR was irritant, the irritation of wpPR on mucous membrane is weakened. The effects of wpPR on improving immunity and lowering blood sugar in mice were stronger than raw PR.The comprehensive score of wpPR pieces was higher, the process of wpPR was stable, reasonable and feasible. wpPR prepared by this process can reduce irritation, enhance immune function and hypoglycemic effect, which provided a reference for the processing technology research and clinical medication of PR.

AHP-entropy weight method; Box-Behnken design-response surface methodology; wine-processed; processing technology; irritation; immunomodulatory; hypoglycemic effect; diosgenin; 5-hydroxymethylfurfural

R283.6

A

0253 - 2670(2023)14 - 4467 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.007

2023-01-03

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1707000）

石雙慧（1999—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬录夹g(shù)與中藥炮制原理研究。E-mail: a18801377903@163.com

王英姿（1975—），女，教授，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬录夹g(shù)與中藥炮制原理研究。E-mail: wangyzi@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]