王繼雙，李莉，王海燕，許鳴鏑

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

化妝品原料品種繁多，營(yíng)養(yǎng)豐富，易受到微生物的污染，導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，因此，化妝品中需要添加防腐劑。防腐劑主要通過(guò)干擾微生物細(xì)胞中的代謝酶、核酸和蛋白質(zhì)等的合成，抑制微生物的生長(zhǎng)，從而起到防腐的作用[1?2]。

傳統(tǒng)的防腐劑主要有尼泊金酯類、苯氧乙醇、卡松系列、甲醛釋放體等。隨著研究的深入和安全評(píng)估數(shù)據(jù)的積累，一些傳統(tǒng)防腐劑的安全問(wèn)題受到越來(lái)越多的關(guān)注，如尼泊金酯類具有潛在的內(nèi)分泌干擾特性，卡松類會(huì)引起皮膚接觸性皮炎，甲醛釋放體為致癌物對(duì)粘膜有刺激性等[3?4]，因此人們開(kāi)始尋找其它的防腐體系。

對(duì)羥基苯乙酮(C8H8O2)又名4-羥基苯乙酮，是一種天然植物提取物，能在較大的pH 值、溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定性，具有抗氧化、抗刺激、增強(qiáng)防腐的作用。有報(bào)道稱對(duì)羥基苯乙酮對(duì)眼睛、呼吸道和皮膚會(huì)產(chǎn)生一定的刺激作用[5?6]。

對(duì)茴香酸即對(duì)甲氧基苯甲酸，又名P-茴香酸、大茴香酸、茴香酸，來(lái)源于天然物質(zhì)茴香油和茴香菜，是一種有機(jī)酸，不屬于防腐劑，但有較好的防腐效果，常作為香料和防腐助劑出現(xiàn)在化妝品配方中[7]。

辛酰羥肟酸，又名辛酰異羥肟酸、辛基羥肟酸、N-羥基正辛酰胺，是一種有機(jī)酸，對(duì)金屬離子有較強(qiáng)的螯合作用，能夠高效螯合鐵離子，使霉菌在鐵離子缺乏的環(huán)境中生長(zhǎng)受到抑制，從而防止化妝品變質(zhì)，延長(zhǎng)保質(zhì)期[1,8]。辛酰羥肟酸無(wú)急性毒性、亞慢性毒性、發(fā)育和生殖毒性等。目前除澳大利亞、韓國(guó)對(duì)辛酰羥肟酸有最大使用濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不超過(guò)0.3%的規(guī)定外，其它國(guó)家暫無(wú)使用限制說(shuō)明[9?10]。

對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸收錄在《已使用化妝品原料名稱目錄》(2015 年版)中，但不在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)的可用防腐劑列表中，不屬于防腐劑，常作為防腐助劑使用，屬于替代防腐劑。由于一些傳統(tǒng)防腐劑存在安全隱患，越來(lái)越多的化妝品生產(chǎn)商開(kāi)始使用替代防腐劑，一些聲稱“不含防腐劑”的產(chǎn)品中，大多是添加了替代防腐劑。目前，對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸無(wú)使用范圍和使用限量的規(guī)定，相關(guān)檢測(cè)方法也未建立，處于監(jiān)管盲區(qū)，因此建立快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)監(jiān)督管理化妝品市場(chǎng)中對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸有重要的意義。

化妝品中對(duì)羥基苯乙酮的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[11-13,6]和高效液相色譜-質(zhì)譜法[14]。對(duì)茴香酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[15]。辛酰羥肟酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1,9,16]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]。目前報(bào)道多種防腐劑同時(shí)檢測(cè)的文獻(xiàn)中多包含對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸中的一種或兩種[5,9,11,15]，同時(shí)包含三種的尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者建立了同時(shí)測(cè)定化妝品中對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸含量的高效液相色譜法，可為對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和監(jiān)督管理提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260VL型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子天平：AX205型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

渦旋振蕩器：Vortex-5型，江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

超聲波清洗器：KQ 700DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水系統(tǒng)：Advance RO+Pro VF型，德國(guó)賽多利斯公司。

對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.0%，廣州佳途科技股份有限公司。

對(duì)茴香酸對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))大于99.0%，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

辛酰羥肟酸對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為98.8%，廣州佳途科技股份有限公司。

甲醇和乙腈：均為色譜純，德國(guó)默克公司。

磷酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

化妝品樣品：包括爽膚水、面膜、凝膠和面霜，均購(gòu)自電商平臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，符合GB/T 6682—2008 一級(jí)水要求。

1.2 色譜條件

色譜柱：Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本大阪曹達(dá)株式會(huì)社)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流動(dòng)相：A相為水(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸)，B相為乙腈，梯度洗脫，0～20 min A 體積分?jǐn)?shù)由90%降至50%，20～21 min，A 體積分?jǐn)?shù)由50%降至10%，21～23 min，A 體積分?jǐn)?shù)保持10%，23～23.5 min，A 體積分?jǐn)?shù)由10%上升至90%，23.5～26 min，A 體積分?jǐn)?shù)保持90%，流量為1.0 mL/min。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 溶液配制

單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別精密稱取對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸對(duì)照品10 mg 于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，配制成1 000 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：取對(duì)羥基苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、對(duì)茴香酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和辛酰羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，配制成對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸的質(zhì)量濃度均分別為2.5、5、10、20、40、60 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液：精密稱取化妝品樣品1.0 g (精確至0.000 1 g)于10 mL 具塞比色管中，用80%甲醇溶液定容至標(biāo)線，振蕩30 s，超聲提取10 min，冷卻至室溫，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

1.3.2 測(cè)定方法

取樣品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定。以色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

在1.2色譜條件下，在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描3 種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸收光譜如圖1 所示。結(jié)果顯示，對(duì)羥基苯乙酮在220、275 nm附近有較強(qiáng)的紫外吸收，對(duì)茴香酸在210、255 nm附近有較強(qiáng)的紫外吸收，辛酰羥肟酸在210 nm附近有較強(qiáng)的紫外吸收。在不影響靈敏度的前提下，為了便于檢測(cè)，選擇3種物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

圖1 對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸及辛酰羥肟酸紫外吸收光譜圖

2.2 流動(dòng)相選擇

參考文獻(xiàn)[1,5,11]，試驗(yàn)考察了0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液-乙腈、0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸溶液-乙腈、0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)磷酸溶液-乙腈3種流動(dòng)相體系對(duì)加標(biāo)樣品溶液(對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸的加標(biāo)質(zhì)量濃度均為50 mg/L)中3種目標(biāo)物的分離效果和色譜峰形，色譜圖如圖2 所示。結(jié)果表明，3種流動(dòng)相體系均能有效分離3種目標(biāo)化合物，而使用0.1%甲酸溶液-乙腈和0.1%乙酸溶液-乙腈的流動(dòng)相體系會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)基線不穩(wěn)，因此選擇0.1%磷酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相。

圖2 不同流動(dòng)相下加標(biāo)樣品溶液色譜圖

2.3 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Dikma DIAMONSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對(duì)加標(biāo)樣品溶液(對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸的加標(biāo)量均為50 mg/L)中3 種目標(biāo)物的分離效果。3 種色譜柱的色譜分離參數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果表明，3種色譜柱均能有效分離目標(biāo)物，與Agilent ZORBAX SB-C18柱和Dikma DIAMONSIL C18柱相比，Osaka Soda Capcell Pak MG C18色譜柱的分離度更好，柱效更高，且色譜峰形更加對(duì)稱，因此選用Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為分離色譜柱。圖3為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液、加標(biāo)樣品溶液色譜圖。

表1 不同色譜柱色譜分離參數(shù)

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液及加標(biāo)樣品溶液色譜圖

2.4 提取條件的選擇

分別以體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%的甲醇溶液為提取劑，考察不同超聲時(shí)間(10、20、30、40 min)下3種目標(biāo)物的色譜峰面積，相對(duì)峰面積越大表明提取效果越好，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸以80%的甲醇溶液超聲提取10 min提取效果最好，對(duì)羥基苯乙酮以100%的甲醇溶液超聲提取10 min提取效果最好，以80%的甲醇溶液超聲提取10 min提取效果次之。綜合考慮，3種目標(biāo)物的提取條件為80%甲醇溶液超聲提取10 min。

圖4 不同提取試劑、超聲時(shí)間下目標(biāo)物提取率

2.5 線性方程與檢出限

在設(shè)定的色譜條件下，測(cè)定對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取質(zhì)量濃度為2.5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，在1.2色譜條件下測(cè)定，以信噪比為3∶1對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限。3 種目標(biāo)物質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表2。結(jié)果表明，對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸質(zhì)量濃度在2.5～60 mg/L范圍內(nèi)，與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 8。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)爽膚水、面膜、凝膠、面霜4 種基質(zhì)的空白樣品進(jìn)行3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 數(shù)據(jù)可知，目標(biāo)物低、中、高三個(gè)水平的加標(biāo)回收率為85.8%～111.1%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于5.9%。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語(yǔ)

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸含量的分析方法。該方法樣品處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，可用于化妝品中對(duì)羥基苯乙酮、對(duì)茴香酸和辛酰羥肟酸的同時(shí)測(cè)定。