王繼雙，李莉，王海燕，許鳴鏑

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

化妝品原料品種繁多，營養(yǎng)豐富，易受到微生物的污染，導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，因此，化妝品中需要添加防腐劑。防腐劑主要通過干擾微生物細胞中的代謝酶、核酸和蛋白質(zhì)等的合成，抑制微生物的生長，從而起到防腐的作用[1?2]。

傳統(tǒng)的防腐劑主要有尼泊金酯類、苯氧乙醇、卡松系列、甲醛釋放體等。隨著研究的深入和安全評估數(shù)據(jù)的積累，一些傳統(tǒng)防腐劑的安全問題受到越來越多的關(guān)注，如尼泊金酯類具有潛在的內(nèi)分泌干擾特性，卡松類會引起皮膚接觸性皮炎，甲醛釋放體為致癌物對粘膜有刺激性等[3?4]，因此人們開始尋找其它的防腐體系。

對羥基苯乙酮(C8H8O2)又名4-羥基苯乙酮，是一種天然植物提取物，能在較大的pH 值、溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定性，具有抗氧化、抗刺激、增強防腐的作用。有報道稱對羥基苯乙酮對眼睛、呼吸道和皮膚會產(chǎn)生一定的刺激作用[5?6]。

對茴香酸即對甲氧基苯甲酸，又名P-茴香酸、大茴香酸、茴香酸，來源于天然物質(zhì)茴香油和茴香菜，是一種有機酸，不屬于防腐劑，但有較好的防腐效果，常作為香料和防腐助劑出現(xiàn)在化妝品配方中[7]。

辛酰羥肟酸，又名辛酰異羥肟酸、辛基羥肟酸、N-羥基正辛酰胺，是一種有機酸，對金屬離子有較強的螯合作用，能夠高效螯合鐵離子，使霉菌在鐵離子缺乏的環(huán)境中生長受到抑制，從而防止化妝品變質(zhì)，延長保質(zhì)期[1,8]。辛酰羥肟酸無急性毒性、亞慢性毒性、發(fā)育和生殖毒性等。目前除澳大利亞、韓國對辛酰羥肟酸有最大使用濃度(質(zhì)量分數(shù))不超過0.3%的規(guī)定外，其它國家暫無使用限制說明[9?10]。

對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸收錄在《已使用化妝品原料名稱目錄》(2015 年版)中，但不在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)的可用防腐劑列表中，不屬于防腐劑，常作為防腐助劑使用，屬于替代防腐劑。由于一些傳統(tǒng)防腐劑存在安全隱患，越來越多的化妝品生產(chǎn)商開始使用替代防腐劑，一些聲稱“不含防腐劑”的產(chǎn)品中，大多是添加了替代防腐劑。目前，對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸無使用范圍和使用限量的規(guī)定，相關(guān)檢測方法也未建立，處于監(jiān)管盲區(qū)，因此建立快速、準確、簡便的檢測方法對監(jiān)督管理化妝品市場中對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸有重要的意義。

化妝品中對羥基苯乙酮的檢測方法主要有高效液相色譜法[11-13,6]和高效液相色譜-質(zhì)譜法[14]。對茴香酸的檢測方法主要有高效液相色譜法[15]。辛酰羥肟酸的檢測方法主要有高效液相色譜法[1,9,16]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]。目前報道多種防腐劑同時檢測的文獻中多包含對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸中的一種或兩種[5,9,11,15]，同時包含三種的尚未見報道。筆者建立了同時測定化妝品中對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸含量的高效液相色譜法，可為對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸的風險評估和監(jiān)督管理提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260VL型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：AX205型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

渦旋振蕩器：Vortex-5型，江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

超聲波清洗器：KQ 700DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水系統(tǒng)：Advance RO+Pro VF型，德國賽多利斯公司。

對羥基苯乙酮對照品：純度(質(zhì)量分數(shù))為99.0%，廣州佳途科技股份有限公司。

對茴香酸對照品：純度(質(zhì)量分數(shù))大于99.0%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

辛酰羥肟酸對照品：純度(質(zhì)量分數(shù))為98.8%，廣州佳途科技股份有限公司。

甲醇和乙腈：均為色譜純，德國默克公司。

磷酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

化妝品樣品：包括爽膚水、面膜、凝膠和面霜，均購自電商平臺。

實驗用水為超純水，符合GB/T 6682—2008 一級水要求。

1.2 色譜條件

色譜柱：Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本大阪曹達株式會社)；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL；檢測波長：210 nm；流動相：A相為水(含質(zhì)量分數(shù)為0.1%的磷酸)，B相為乙腈，梯度洗脫，0～20 min A 體積分數(shù)由90%降至50%，20～21 min，A 體積分數(shù)由50%降至10%，21～23 min，A 體積分數(shù)保持10%，23～23.5 min，A 體積分數(shù)由10%上升至90%，23.5～26 min，A 體積分數(shù)保持90%，流量為1.0 mL/min。

1.3 實驗步驟

1.3.1 溶液配制

單一標準儲備溶液：分別精密稱取對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸對照品10 mg 于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標線，配制成1 000 mg/L的單一標準儲備溶液。

混合標準溶液：取對羥基苯乙酮標準儲備溶液、對茴香酸標準儲備溶液和辛酰羥肟酸標準儲備溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標線，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的混合標準溶液。

系列混合標準溶液：用甲醇將上述混合標準溶液逐級稀釋，配制成對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸的質(zhì)量濃度均分別為2.5、5、10、20、40、60 mg/L的系列混合標準溶液。

樣品溶液：精密稱取化妝品樣品1.0 g (精確至0.000 1 g)于10 mL 具塞比色管中，用80%甲醇溶液定容至標線，振蕩30 s，超聲提取10 min，冷卻至室溫，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

1.3.2 測定方法

取樣品溶液，在1.2色譜條件下測定。以色譜峰面積標準曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長選擇

在1.2色譜條件下，在210～400 nm波長范圍內(nèi)掃描3 種物質(zhì)的混合標準溶液，吸收光譜如圖1 所示。結(jié)果顯示，對羥基苯乙酮在220、275 nm附近有較強的紫外吸收，對茴香酸在210、255 nm附近有較強的紫外吸收，辛酰羥肟酸在210 nm附近有較強的紫外吸收。在不影響靈敏度的前提下，為了便于檢測，選擇3種物質(zhì)的檢測波長為210 nm。

圖1 對羥基苯乙酮、對茴香酸及辛酰羥肟酸紫外吸收光譜圖

2.2 流動相選擇

參考文獻[1,5,11]，試驗考察了0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液-乙腈、0.1%(體積分數(shù)，下同)乙酸溶液-乙腈、0.1%(體積分數(shù)，下同)磷酸溶液-乙腈3種流動相體系對加標樣品溶液(對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸的加標質(zhì)量濃度均為50 mg/L)中3種目標物的分離效果和色譜峰形，色譜圖如圖2 所示。結(jié)果表明，3種流動相體系均能有效分離3種目標化合物，而使用0.1%甲酸溶液-乙腈和0.1%乙酸溶液-乙腈的流動相體系會導(dǎo)致系統(tǒng)基線不穩(wěn)，因此選擇0.1%磷酸溶液-乙腈作為流動相。

圖2 不同流動相下加標樣品溶液色譜圖

2.3 色譜柱的選擇

試驗考察了Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Dikma DIAMONSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對加標樣品溶液(對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸的加標量均為50 mg/L)中3 種目標物的分離效果。3 種色譜柱的色譜分離參數(shù)見表1。結(jié)果表明，3種色譜柱均能有效分離目標物，與Agilent ZORBAX SB-C18柱和Dikma DIAMONSIL C18柱相比，Osaka Soda Capcell Pak MG C18色譜柱的分離度更好，柱效更高，且色譜峰形更加對稱，因此選用Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為分離色譜柱。圖3為混合標準溶液、空白樣品溶液、加標樣品溶液色譜圖。

表1 不同色譜柱色譜分離參數(shù)

圖3 混合標準溶液、空白樣品溶液及加標樣品溶液色譜圖

2.4 提取條件的選擇

分別以體積分數(shù)為60%、70%、80%、90%、100%的甲醇溶液為提取劑，考察不同超聲時間(10、20、30、40 min)下3種目標物的色譜峰面積，相對峰面積越大表明提取效果越好，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，對茴香酸和辛酰羥肟酸以80%的甲醇溶液超聲提取10 min提取效果最好，對羥基苯乙酮以100%的甲醇溶液超聲提取10 min提取效果最好，以80%的甲醇溶液超聲提取10 min提取效果次之。綜合考慮，3種目標物的提取條件為80%甲醇溶液超聲提取10 min。

圖4 不同提取試劑、超聲時間下目標物提取率

2.5 線性方程與檢出限

在設(shè)定的色譜條件下，測定對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸系列混合標準溶液，以3 種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取質(zhì)量濃度為2.5 mg/L的混合標準溶液，用甲醇逐級稀釋，在1.2色譜條件下測定，以信噪比為3∶1對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限。3 種目標物質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。結(jié)果表明，對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸質(zhì)量濃度在2.5～60 mg/L范圍內(nèi)，與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 8。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6 加標回收與精密度試驗

按照實驗方法分別對爽膚水、面膜、凝膠、面霜4 種基質(zhì)的空白樣品進行3 個濃度水平的加標回收試驗，每個濃度水平重復(fù)6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差，結(jié)果見表3。由表3 數(shù)據(jù)可知，目標物低、中、高三個水平的加標回收率為85.8%～111.1%，測定結(jié)果的相對標準偏差均不大于5.9%。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法同時測定化妝品中對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸含量的分析方法。該方法樣品處理簡單，靈敏度高，準確性好，可用于化妝品中對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸的同時測定。