翟宏焱，周光姣，王超群

（1.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230051；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800）；3.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，合肥 230061；4.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，合肥 230601

五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”，秋季果實(shí)成熟時(shí)采摘，曬干或蒸后曬干，除去果梗和雜質(zhì)。五味子具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心之功效[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，五味子中含有木脂素類化合物、揮發(fā)油類和三萜類等活性成分[2]，其中木脂素類化合物約占總成分的8% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))[3]，木脂素類化合物是五味子最主要的生物活性成分之一[4]，具有保肝護(hù)肝、鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[5]，聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素是五味子具有代表性的成分，因此選擇聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素為五味子內(nèi)部質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)藥材質(zhì)量控制具有重要意義。常見(jiàn)的聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素有五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲等。五味子中多種木脂素類成分含量的測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道[6?7]，但這些方法難以在實(shí)際工作中廣泛應(yīng)用，其主要原因是對(duì)照品價(jià)格昂貴，貨源緊缺等，因此，如何實(shí)現(xiàn)用單一對(duì)照品對(duì)五味子藥材進(jìn)行多指標(biāo)的質(zhì)量控制，是目前五味子質(zhì)量控制中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

PB 試驗(yàn)法是Plackett-Burman 試驗(yàn)法的簡(jiǎn)稱，通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以從眾多影響因素中篩選出主要影響因素，準(zhǔn)確有效地優(yōu)選響應(yīng)面顯著因子。中心組合設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法(CCD-RSM)是近年來(lái)廣泛使用的工藝優(yōu)化方法，是一種非線性模型擬合，具有比單因素分析方法有效、比正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)簡(jiǎn)化、比均勻設(shè)計(jì)更全面的特點(diǎn)[8]。

一測(cè)多評(píng)(QAMS)法即以樣品中某一成分為內(nèi)參比物，建立其它成分與該成分之間的相對(duì)校正因子，通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算其它成分含量，實(shí)現(xiàn)多成分同步測(cè)定[9?11]。該方法能有效解決對(duì)照品短缺和檢測(cè)成本高的問(wèn)題，尤其適用于中藥材多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制，該法早在2010 年已被《中國(guó)藥典》(2010版)收錄。有文獻(xiàn)報(bào)道采用該方法測(cè)定五味子中8 種[12]和12 種木質(zhì)素類成分含量[13]，由于指標(biāo)成分太多，在實(shí)際應(yīng)用中較難實(shí)現(xiàn)質(zhì)量監(jiān)測(cè)。

筆者采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)(PBD)篩選影響色譜峰分離度的關(guān)鍵因素，利用中心組合設(shè)計(jì)-效應(yīng)面(CCD-RSM)法對(duì)關(guān)鍵分析參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，選擇五味子中含量較高的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素建立一測(cè)多評(píng)方法，以期實(shí)現(xiàn)五味子木脂素類成分的質(zhì)量控制。五味子醇甲在五味子中含量最高，該對(duì)照品價(jià)廉易得，且2020 版《中國(guó)藥典》中規(guī)定五味子醇甲作為五味子含量測(cè)定指標(biāo)，故選擇五味子醇甲為參照物，計(jì)算五味子醇甲與五味子甲素、五味子乙素之間的相對(duì)校正因子，利用相對(duì)校正因子計(jì)算五味子甲素、五味子乙素含量，并將結(jié)果與外標(biāo)法(ESM)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，從而驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：(1) Ultimate 3000 型，配DAD檢測(cè)器，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；(2)Agilent 1290 Infinit Ⅱ型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；(3) Waters2695型，美國(guó)沃特世科技有限公司。

電子天平：(1) XP56 型，感量為0.001 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；(2) BSA224S 型，感量為0.1 mg，賽多利斯儀器(北京)有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：TC-SY-1000 型，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

純水/超純水一體化系統(tǒng)：Milli-Q Direct 16 型，美國(guó)密理博公司。

五味子醇甲對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.7%，編號(hào)為110857-201815，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

五味子甲素對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.5%，編號(hào)為110764-201915，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

五味子乙素對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.1%，編號(hào)為110765-201813，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司。

實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

五味子藥材樣品：從中藥材市場(chǎng)收集10批五味子藥材，具體批號(hào)及產(chǎn)地見(jiàn)表1，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳偉副教授鑒定，樣品為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)。

表1 五味子樣品編號(hào)及產(chǎn)地信息

1.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津儀器有限公司)，附DAD 檢測(cè)器；流動(dòng)相：甲醇-水(體積比為70∶30，下同)溶液，流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 溶液的制備

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密稱取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品適量，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲溶解并定容，混勻，配制成五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.2、0.5、2、5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的質(zhì)量濃度均分別為5.0、20.0、50.0、200.0、500.0 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

樣品溶液[14]：用1＃樣品進(jìn)行分析條件優(yōu)化及方法學(xué)考察。取過(guò)孔徑為355 μm (50 目)篩的五味子藥材粉末0.25 g，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加入正己烷約18 mL，超聲處理(功率為300 W，頻率為45 kHz) 30 min，取出，加入正己烷至標(biāo)線，搖勻，濾過(guò)，量取續(xù)濾液10 mL 至蒸發(fā)皿中，揮干，加入甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，搖勻，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，建立五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 關(guān)鍵分析參數(shù)篩選

2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，以流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)(φ)、柱溫(T)、流動(dòng)相流量(L)、進(jìn)樣體積(V)為4 個(gè)考察因素，五味子醇甲色譜峰與雜質(zhì)峰的分離度(Y)為關(guān)鍵屬性質(zhì)量[15]。每個(gè)影響因素取2 個(gè)水平，以高水平(1)和低水平(-1)表示，利用Minitab軟件設(shè)計(jì)12組實(shí)驗(yàn)，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 PBD試驗(yàn)方案與結(jié)果

2.1.2 PBD試驗(yàn)方案與結(jié)果

利用PBD對(duì)具有一定風(fēng)險(xiǎn)的因素進(jìn)行篩選，使用Minitab 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[16]。PBD 試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)(φ)和柱溫(T)對(duì)分離度(Y)有顯著性影響(P＜0.05)，其它因素為非關(guān)鍵分析因素。應(yīng)用CCD-RSM 法對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)(φ)和柱溫(T)進(jìn)一步優(yōu)化，最終將流動(dòng)相流量、進(jìn)樣體積分別選擇為1.0 mL/min、10 μL。

表3 PBD試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.1.3 CCD-RSM優(yōu)化液相條件

結(jié)合上述Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)甲醇體積分?jǐn)?shù)(φ)、柱溫(T)對(duì)五味子醇甲色譜峰與雜質(zhì)峰的分離度(Y)的影響較大，故選擇φ、T作為考察因素進(jìn)一步進(jìn)行液相條件優(yōu)化。運(yùn)用Design-Expert 13.0 軟件中CCD-RSM 法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素分別設(shè)置5個(gè)水平：即-1.414、-1、0、1、1.414，選取五味子醇甲的分離度(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立Y與關(guān)鍵質(zhì)量屬性φ、T之間的數(shù)學(xué)模型[17]，CCD-RSM 試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 CCD-RSM試驗(yàn)方案及響應(yīng)值

采用Design-Expert 13.0 軟件，對(duì)表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)分離度進(jìn)行二次回歸擬合，得回歸方程：Y=211.227 86-1.137 79φ-9.381 82T+0.015 200φT+0.001 535φ2+0.128 940T2，判別系數(shù)R2=0.975 1。其中Y、φ、T分別代表分離度、甲醇體積分?jǐn)?shù)、柱溫。表明該模型擬合度較好，能比較準(zhǔn)確地分析和預(yù)測(cè)五味子醇甲的分離條件。

CCD-RSM方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，φ、T項(xiàng)的P值均小于0.05，表明對(duì)Y有顯著性影響。失擬項(xiàng)表示所得模型與試驗(yàn)擬合的程度，即二者差異的程度，本實(shí)驗(yàn)失擬項(xiàng)的P值為0.114 5，P＞0.05，表明方程模型誤差較小，實(shí)驗(yàn)條件滿足要求。

表5 CCD-RSM方差分析結(jié)果

2.1.4 條件優(yōu)化與預(yù)測(cè)

利用Design-Expert.13軟件求導(dǎo)，可得當(dāng)流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%、柱溫為35 ℃時(shí)，分離度為5.932。根據(jù)模型分析結(jié)果，得最優(yōu)色譜條件(見(jiàn)1.2)。

2.1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照1.2 色譜條件，平行測(cè)定3 份樣品溶液，測(cè)得分離度平均值為5.98。將所得實(shí)測(cè)值與分離度回歸方程預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，計(jì)算平均偏差為1.05%。偏差較小，表明該模型有效。

2.2 一測(cè)多評(píng)法建立

2.2.1 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察

按照1.2 色譜條件，分別精密吸取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液及加標(biāo)樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，色譜圖如圖1。

圖1 高效液相色譜圖

(1) 線性關(guān)系。在1.2 色譜條件下，分別測(cè)定系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以待測(cè)組分的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的質(zhì)量濃度在5～500 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表6 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的線性關(guān)系

(2) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取樣品溶液分別于第0、2、8、12、24、36 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，五味子醇甲、五味子甲素和五味乙素的色譜峰面積測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.3%、2.9%、2.6%，表明樣品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(3) 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)。取適量已知含量的序號(hào)為1 的五味子藥材粉末6 份，各約0.15 g，精密稱定，定量加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL (五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素濃度分別為0.850 1、0.252 1、0.250 8 mg/mL)，按照1.3 方法制備樣品溶液，按所建試驗(yàn)方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的平均加標(biāo)回收率分別為100.1%、100.6%、100.3%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%、1.8%、1.1%(n=6)。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表8 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 相對(duì)校正因子的確定

按照1.2 色譜條件，精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、10、15、20 μL，測(cè)定各成分的色譜峰面積，以五味子醇甲為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算五味子甲素、五味子乙素與五味子醇甲之間的相對(duì)校正因子[18?20]，相對(duì)校正因子按照式(1)計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 兩種成分的相對(duì)校正因子

式中：fs/i——參照物與目標(biāo)成分的相對(duì)校正因子；

fs——參照物的絕對(duì)校正因子；

fi——目標(biāo)成分的絕對(duì)校正因子；

As——參照物色峰面積；

ρs——參照物質(zhì)量濃度，mg/mL；

Ai——待測(cè)成分色譜峰面積；

ρi——待測(cè)成分質(zhì)量濃度，mg/mL。

2.2.3 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

取不同批號(hào)的藥材，分別采用外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的量，并將兩種方法所得結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證QAMS 法用于五味子中木脂素類多指成分標(biāo)含量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表10。由表10 數(shù)據(jù)可知，采用QAMS 法及外標(biāo)法所測(cè)得的五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的結(jié)果基本一致，表明建立的QAMS方法準(zhǔn)確、可靠。

表10 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素測(cè)定結(jié)果 mg/g

3 結(jié)語(yǔ)

建立了測(cè)定五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的QAMS法。五味子甲素、五味子乙素與五味子醇甲的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好，QAMS 法與外標(biāo)法所得結(jié)果基本一致，且具有較高的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及可信度。該方法豐富了五味子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并為QAMS技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的推廣和應(yīng)用提供了參考和依據(jù)。