劉清毅，李全發(fā)，周劍，王敏，楊夢(mèng)瑞，王彤彤，于寒松

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

黃豆黃素是一種大豆異黃酮，具有雌性激素及抗雌激素性質(zhì)。它對(duì)于降低前列腺癌、乳腺癌等疾病的發(fā)病率，減輕骨質(zhì)疏松癥和其它因雌激素缺乏導(dǎo)致的綜合癥具有重要功效，而且它還可以預(yù)防心血管等疾病[1]。大豆異黃酮也可以用作動(dòng)物生產(chǎn)的調(diào)節(jié)劑和促進(jìn)劑，起到促進(jìn)動(dòng)物繁殖、泌乳和生長(zhǎng)的作用[2]。鑒于其具有多種有益功效，黃豆黃素常被作為一種功能強(qiáng)化劑添加入食品、保健品或飼料產(chǎn)品中[3]，然而，經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)查詢，目前還沒有黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，市售標(biāo)準(zhǔn)品良莠不齊，存在量值偏差，制約了黃豆黃素的準(zhǔn)確測(cè)量。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為保證測(cè)量準(zhǔn)確性的重要因素，在量值傳遞、評(píng)價(jià)方法和儀器校準(zhǔn)中發(fā)揮著重要作用。筆者采用市售標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過純化處理和定性確證后，采用兩種不同原理的高準(zhǔn)確度純度定值方法定值，滿足JJF 1855—2020[4]對(duì)于純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的要求，對(duì)于保證黃豆黃素含量的準(zhǔn)確測(cè)量提供了技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

紅外光譜儀：IRT racer-100型，日本SHIMADZU公司。

質(zhì)譜儀：(1)Triple Quad 3500 型；(2)TOF MS6600型。美國(guó)AB SCIEX公司。

核磁共振儀：AVANCE Ⅲ型，400 MHz，瑞士布魯克公司。

電子天平：(1)UMX2 型，感量為0.001 mg；(2)XS105 型，感量為0.01 mg。瑞士梅特勒-托利多公司。

水分滴定儀：DL32 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

氣相色譜儀：7890型，配有7697 A頂空進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

高效液相色譜儀：2695型，美國(guó)沃特世公司。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：X series 2 型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

真空冷凍干燥機(jī)：Genesis 25L 型，中國(guó)香港德祥公司。

電恒溫培養(yǎng)箱：DHP-600 s型，溫度范圍為25～65 ℃，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)稱純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))大于98%，四川格純生物醫(yī)藥有限公司。

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)為GBW 06117，純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.993%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

氘代乙酸、氘代甲醇、氘代N，N-二甲基甲酰胺、氘水和氘代二甲基亞砜：分析純，北京百靈威科技有限公司。

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、二甲苯、正己烷：色譜純，德國(guó)默克公司。

磷酸、硝酸、雙氧水：優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

鋁、鈣、銅等單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)、各元素質(zhì)量濃度見表1，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

表1 單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料純化

選用黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，使用烘箱和真空冷凍干燥機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行加熱和冷凍干燥除水，使用卡爾費(fèi)休庫(kù)倫滴定法確定樣品含水量為0.30%。初測(cè)液相純度大于99%。

1.2.2 定性分析

分別采用紅外光譜法、質(zhì)譜法和核磁氫譜法，對(duì)純化后的黃豆黃素原料進(jìn)行定性確認(rèn)。

1.2.3 均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)JJF 1343—2012[5]的技術(shù)要求，對(duì)分裝好的黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)隨機(jī)抽樣，抽樣原則應(yīng)盡量覆蓋分裝過程各個(gè)時(shí)間段，隨機(jī)抽取11個(gè)包裝單位進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，每個(gè)單元配制三個(gè)子樣，稱樣量均為5 mg，分別配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L 的甲醇溶液，對(duì)配制的溶液進(jìn)行編號(hào)，從1到11。每個(gè)溶液進(jìn)行3次測(cè)定，測(cè)定順序依次為1，2，3，…，11；11，10，9，…，1；1，2，3，…，11。

1.2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是其基本屬性，主要包括長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性和運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性。以JJF 1343—2012的基本要求為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)和短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)，均采用擬合直線對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。長(zhǎng)期穩(wěn)定檢驗(yàn)采用規(guī)范推薦的經(jīng)典評(píng)估方式，時(shí)間點(diǎn)為0、1、3、6、12 個(gè)月；短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)采用規(guī)范推薦的同步檢驗(yàn)方式，溫度分別設(shè)定為20、40、60 ℃，考察時(shí)間為0、1、3、5、7天。

1.2.5 純度定值

(1)質(zhì)量平衡法純度定值。質(zhì)量平衡法[6]也叫雜質(zhì)扣除法，是一種對(duì)目標(biāo)化合物主成分純度、各個(gè)雜質(zhì)分別測(cè)量，并獲得目標(biāo)物最終純度的方法。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜主成分色譜峰面積歸一化法[7]測(cè)定黃豆黃素純度，采用卡爾費(fèi)休庫(kù)倫法[8]測(cè)定水分含量，采用頂空氣相色譜法[9]測(cè)定揮發(fā)性雜質(zhì)含量，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]測(cè)定不揮發(fā)性雜質(zhì)含量。測(cè)量設(shè)備如天平、容量瓶、液相色譜等儀器均經(jīng)過計(jì)量檢定，以保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性、溯源性。

(2)定量核磁法純度定值。定量核磁法[11]是通過測(cè)量目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的不同原子核共振吸收峰的面積，并結(jié)合吸收峰對(duì)應(yīng)的原子數(shù)計(jì)算目標(biāo)物純度值，這種純度定值方法主要通過選擇國(guó)家一級(jí)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法定值，通過優(yōu)化核磁條件，準(zhǔn)確測(cè)量不同原子核吸收峰，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)純度的準(zhǔn)確測(cè)量，并將定量核磁測(cè)量結(jié)果通過有證純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接溯源到SI單位。

1.2.6 不確定度評(píng)定

研制的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度來源主要包括三個(gè)方面，分別是(1)定值過程引入的不確定度；(2)純度不均勻引入的不確定度[12]；(3)不穩(wěn)定性引入的不確定度[13]。其中定值過程引入的不確定度按照J(rèn)JF 1855—2021 進(jìn)行評(píng)定，主要包括質(zhì)量平衡法定值引入的不確定度和定量核磁法定值引入的不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物選擇及純化

選用四川格純生物醫(yī)藥有限公司市售的黃豆黃素作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，使用烘箱和真空冷凍干燥機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行加熱和冷凍干燥除水后，使用卡爾費(fèi)休庫(kù)倫滴定法確定樣品含水量為0.30%。初測(cè)液相純度大于99%。使用1.5 mL 棕色進(jìn)樣小瓶對(duì)充分混勻的樣品，在潔凈、干燥的環(huán)境下[溫度(20±5) ℃，濕度(40±10)%進(jìn)行分裝。每瓶樣品包裝量為20 mg，共分裝113個(gè)單元，分裝好的樣品貯存于干燥器內(nèi)，于(20±5) ℃下干燥避光保存。

2.2 定性分析

圖1 為黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物紅外光譜圖，對(duì)特征峰進(jìn)行歸屬分析，主要特征吸收峰跟黃豆黃素結(jié)構(gòu)相符合。圖2為黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的質(zhì)譜圖，主要碎片離子質(zhì)荷比(m/z)分別為285.1、270.1、242.2，與文獻(xiàn)[14]記載的定性離子對(duì)相符合，經(jīng)過分析可知，這些質(zhì)譜峰分別屬于[M+H]+、[M+H-OH]+和[M+H-CHO]+。

圖1 黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的紅外光譜圖

圖2 黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的質(zhì)譜圖

圖3 為黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的核磁氫譜圖，典型的化學(xué)位移值均與黃豆黃素結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，分別為3.86×10-6對(duì)應(yīng)于21 號(hào)C 上所連的氫；6.79×10-6～6.83×10-6對(duì)應(yīng)于14、16 號(hào)碳上所連的氫；6.94×10-6對(duì)應(yīng)于6 號(hào)碳上所連的氫；7.37×10-6～7.39×10-6對(duì)應(yīng)于13、17 號(hào)碳上所連的氫；7.43×10-6對(duì)應(yīng)于3 號(hào)碳上所連的氫；8.26×10-6對(duì)應(yīng)于22 號(hào)C上所連的氫；9.50×10-6對(duì)應(yīng)于18 號(hào)C 上所連的氫。經(jīng)紅外、質(zhì)譜和核磁多種定性手段分析，可以確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物為黃豆黃素。

圖3 黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的核磁氫譜圖

2.3 均勻性檢驗(yàn)

按照1.2.3 方法進(jìn)行黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)，測(cè)量結(jié)果見表2。由表2數(shù)據(jù)計(jì)算得總標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.02，總平均值為99.19%，組間方差和為0.000 58，組內(nèi)方差和為0.000 35，F(xiàn)=1.64。查表知F0.05(10，22)=2.30，F(xiàn)＜F0.05(10，22)，表明當(dāng)取樣量為5 mg時(shí)，樣品均勻性良好，因此，在本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制項(xiàng)目中，黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以5 mg 作為最小取樣量。

表2 黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值均勻性評(píng)定結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

按照1.2.4方法，按照先密后疏的原則對(duì)黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)，表3和表4分別為長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)結(jié)果，表5和表6分別是短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)結(jié)果。斜率β1和截距β0是對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果平均值擬合直線獲得，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均顯示|β1|＜t0.95，3?s(β1)。所以判斷本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在設(shè)定的保存溫度下，12個(gè)月內(nèi)量值沒有趨勢(shì)性變化。在低于60 ℃的運(yùn)輸條件下，7天內(nèi)可保證純度量值穩(wěn)定。

表3 黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

表4 黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表5 黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

表6 黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.5 純度定值

2.5.1 質(zhì)量平衡法純度定值

質(zhì)量平衡法按照式(1)對(duì)黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值：

式中：PMB——樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)；

P0——主成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；

XW——水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；

Xn——非揮發(fā)性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；

Xv——揮發(fā)性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[15]。

通過比較不同色譜柱、不同流動(dòng)相、不同分析波長(zhǎng)，確定最優(yōu)的檢測(cè)條件，主要包括采用Agilent Plus -C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)液相色譜柱，采用乙腈和0.15%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，流動(dòng)相體積比為25：75，流量為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇261 nm。將目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品配制成500 mg/L 的甲醇溶液，在上述色譜條件下平行測(cè)定6次，得到主成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

采用卡爾費(fèi)休法進(jìn)行水分測(cè)定，測(cè)定前采用固體水分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)測(cè)量方法，對(duì)黃豆黃素水分含量進(jìn)行6 次平行測(cè)定，每次取樣質(zhì)量為5～7 mg，因?yàn)槭枪腆w進(jìn)樣，測(cè)量過程中開蓋容易引入空氣中的水分，造成測(cè)量不準(zhǔn)確[16]，因此水分測(cè)定結(jié)果應(yīng)扣除試驗(yàn)過程中開蓋引入的空氣中水分值，該水分值采用模擬加樣過程測(cè)定獲得。

采用基于氫火焰檢測(cè)器的頂空氣相色譜法對(duì)揮發(fā)性雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，稱取20 mg 黃豆黃素于20 mL頂空瓶中，加入2 mL 二甲亞砜溶解，采用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、二甲苯、正己烷9種有機(jī)溶劑為揮發(fā)性雜質(zhì)的對(duì)照，用單點(diǎn)法定量。

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析黃豆黃素中23種常見元素含量，以元素含量之和作為不揮發(fā)性雜質(zhì)含量。

黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分、水分、有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)、無機(jī)非揮發(fā)性雜質(zhì)含量測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果列于表7。

表7 黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量平衡法純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))定值結(jié)果%

2.5.2 定量核磁法純度定值

定量核磁法按照式(2)對(duì)黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值[17]：

式中：PNMR——黃豆黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)；

Ix——黃豆黃素定量峰的積分面積；

Istd——內(nèi)標(biāo)物苯甲酸定量峰的積分面積；

nstd——內(nèi)標(biāo)物苯甲酸化學(xué)式中定量峰對(duì)應(yīng)的H原子數(shù)量；

nx——黃豆黃素在化學(xué)式中定量峰對(duì)應(yīng)的H原子數(shù)量；

Mx——黃豆黃素的相對(duì)分子質(zhì)量；

Mstd——內(nèi)標(biāo)物苯甲酸的相對(duì)分子質(zhì)量；

mstd——添加的內(nèi)標(biāo)物苯甲酸的質(zhì)量，g；

mx——黃豆黃素的稱樣質(zhì)量，g；

Pstd——內(nèi)標(biāo)物苯甲酸的純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

為保證定量核磁法定值的準(zhǔn)確性，針對(duì)氘代溶劑、內(nèi)標(biāo)物、定量峰位置、激發(fā)脈沖角度、弛豫時(shí)間以及累計(jì)采樣次數(shù)進(jìn)行了試驗(yàn)，經(jīng)優(yōu)化確定定值用核磁條件：激發(fā)脈沖角度為30°，采樣時(shí)間為4.823 5 s，時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)為64 K，掃描譜寬(SWH)為17.0×10-6，激發(fā)中心(O1P)為8.15×10-6，掃描寬度為6 793.478 Hz，弛豫延遲(D1)為13.99 s，偏置頻率為3 253.22 Hz，接收增益為322，探頭溫度為293.8 K，脈沖序列為zg30，累計(jì)采樣次數(shù)為128次，定量峰為8.36×10-6(Hz)和8.02×10-6(dt，J = 8.0，2.0 Hz)。定量核磁法對(duì)黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6 次定值結(jié)果均值為99.13%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.023%。

按照J(rèn)JF 1855—2020 要求，對(duì)不同的定值結(jié)果應(yīng)采用F檢驗(yàn)進(jìn)行等精度檢驗(yàn)，然后再采用t檢驗(yàn)進(jìn)行平均值一致性檢驗(yàn)，本研究中，兩種定值方法的結(jié)果均通過了F和t檢驗(yàn)，說明兩種方法等精度且平均值一致，因此，黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值以兩種定值結(jié)果的平均值表示，最終定值結(jié)果為99.1%。

2.6 定值不確定度

黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度主要來源于：(1)樣品均勻性；(2)樣品穩(wěn)定性；(3)定值方法。表8列出了各不確定度分量，將表8數(shù)據(jù)合成，得到定值結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel=0.15%，取包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel=k·urel=0.3%，擴(kuò)展不確定度為0.3%，定值結(jié)果為(99.1±0.3)%。

表8 黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評(píng)定結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

采用三種方法對(duì)經(jīng)純化處理后的黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，并確證樣品。采用兩種不同原理的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行純度定值，采用質(zhì)量平衡法進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn)，并對(duì)定值結(jié)果的不確定度進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)定。研制的黃豆黃素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)成功申報(bào)國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。