劉清毅，李全發(fā)，周劍，王敏，楊夢瑞，王彤彤，于寒松

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，長春 130118）

黃豆黃素是一種大豆異黃酮，具有雌性激素及抗雌激素性質(zhì)。它對于降低前列腺癌、乳腺癌等疾病的發(fā)病率，減輕骨質(zhì)疏松癥和其它因雌激素缺乏導致的綜合癥具有重要功效，而且它還可以預防心血管等疾病[1]。大豆異黃酮也可以用作動物生產(chǎn)的調(diào)節(jié)劑和促進劑，起到促進動物繁殖、泌乳和生長的作用[2]。鑒于其具有多種有益功效，黃豆黃素常被作為一種功能強化劑添加入食品、保健品或飼料產(chǎn)品中[3]，然而，經(jīng)國家標準物質(zhì)資源平臺查詢，目前還沒有黃豆黃素純度標準物質(zhì)，市售標準品良莠不齊，存在量值偏差，制約了黃豆黃素的準確測量。

標準物質(zhì)作為保證測量準確性的重要因素，在量值傳遞、評價方法和儀器校準中發(fā)揮著重要作用。筆者采用市售標準品，經(jīng)過純化處理和定性確證后，采用兩種不同原理的高準確度純度定值方法定值，滿足JJF 1855—2020[4]對于純度標準物質(zhì)研制的要求，對于保證黃豆黃素含量的準確測量提供了技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

紅外光譜儀：IRT racer-100型，日本SHIMADZU公司。

質(zhì)譜儀：(1)Triple Quad 3500 型；(2)TOF MS6600型。美國AB SCIEX公司。

核磁共振儀：AVANCE Ⅲ型，400 MHz，瑞士布魯克公司。

電子天平：(1)UMX2 型，感量為0.001 mg；(2)XS105 型，感量為0.01 mg。瑞士梅特勒-托利多公司。

水分滴定儀：DL32 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

氣相色譜儀：7890型，配有7697 A頂空進樣器，美國安捷倫科技有限公司。

高效液相色譜儀：2695型，美國沃特世公司。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：X series 2 型，美國賽默飛世爾科技公司。

真空冷凍干燥機：Genesis 25L 型，中國香港德祥公司。

電恒溫培養(yǎng)箱：DHP-600 s型，溫度范圍為25～65 ℃，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司。

黃豆黃素標準品：標稱純度(質(zhì)量分數(shù))大于98%，四川格純生物醫(yī)藥有限公司。

苯甲酸標準物質(zhì)：國家一級標準物質(zhì)，標準物質(zhì)編號為GBW 06117，純度(質(zhì)量分數(shù))為99.993%，中國計量科學研究院。

氘代乙酸、氘代甲醇、氘代N，N-二甲基甲酰胺、氘水和氘代二甲基亞砜：分析純，北京百靈威科技有限公司。

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、二甲苯、正己烷：色譜純，德國默克公司。

磷酸、硝酸、雙氧水：優(yōu)級純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

鋁、鈣、銅等單元素溶液標準物質(zhì)：標準物質(zhì)編號、各元素質(zhì)量濃度見表1，中國計量科學研究院。

表1 單元素溶液標準物質(zhì)

1.2 實驗方法

1.2.1 原料純化

選用黃豆黃素標準品作為標準物質(zhì)候選物，使用烘箱和真空冷凍干燥機對樣品進行加熱和冷凍干燥除水，使用卡爾費休庫倫滴定法確定樣品含水量為0.30%。初測液相純度大于99%。

1.2.2 定性分析

分別采用紅外光譜法、質(zhì)譜法和核磁氫譜法，對純化后的黃豆黃素原料進行定性確認。

1.2.3 均勻性檢驗

根據(jù)JJF 1343—2012[5]的技術(shù)要求，對分裝好的黃豆黃素標準物質(zhì)隨機抽樣，抽樣原則應盡量覆蓋分裝過程各個時間段，隨機抽取11個包裝單位進行均勻性檢驗，每個單元配制三個子樣，稱樣量均為5 mg，分別配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L 的甲醇溶液，對配制的溶液進行編號，從1到11。每個溶液進行3次測定，測定順序依次為1，2，3，…，11；11，10，9，…，1；1，2，3，…，11。

1.2.4 穩(wěn)定性檢驗

標準物質(zhì)的穩(wěn)定性是其基本屬性，主要包括長期保存的穩(wěn)定性和運輸過程中的穩(wěn)定性。以JJF 1343—2012的基本要求為基礎，設計了長期穩(wěn)定性檢驗試驗和短期穩(wěn)定性檢驗試驗，均采用擬合直線對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。長期穩(wěn)定檢驗采用規(guī)范推薦的經(jīng)典評估方式，時間點為0、1、3、6、12 個月；短期穩(wěn)定性檢驗采用規(guī)范推薦的同步檢驗方式，溫度分別設定為20、40、60 ℃，考察時間為0、1、3、5、7天。

1.2.5 純度定值

(1)質(zhì)量平衡法純度定值。質(zhì)量平衡法[6]也叫雜質(zhì)扣除法，是一種對目標化合物主成分純度、各個雜質(zhì)分別測量，并獲得目標物最終純度的方法。本實驗采用液相色譜主成分色譜峰面積歸一化法[7]測定黃豆黃素純度，采用卡爾費休庫倫法[8]測定水分含量，采用頂空氣相色譜法[9]測定揮發(fā)性雜質(zhì)含量，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]測定不揮發(fā)性雜質(zhì)含量。測量設備如天平、容量瓶、液相色譜等儀器均經(jīng)過計量檢定，以保證測量結(jié)果的準確性、溯源性。

(2)定量核磁法純度定值。定量核磁法[11]是通過測量目標物和內(nèi)標的不同原子核共振吸收峰的面積，并結(jié)合吸收峰對應的原子數(shù)計算目標物純度值，這種純度定值方法主要通過選擇國家一級純度標準物質(zhì)作為內(nèi)標物，采用內(nèi)標法定值，通過優(yōu)化核磁條件，準確測量不同原子核吸收峰，進一步實現(xiàn)純度的準確測量，并將定量核磁測量結(jié)果通過有證純度標準物質(zhì)直接溯源到SI單位。

1.2.6 不確定度評定

研制的純度標準物質(zhì)的不確定度來源主要包括三個方面，分別是(1)定值過程引入的不確定度；(2)純度不均勻引入的不確定度[12]；(3)不穩(wěn)定性引入的不確定度[13]。其中定值過程引入的不確定度按照JJF 1855—2021 進行評定，主要包括質(zhì)量平衡法定值引入的不確定度和定量核磁法定值引入的不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準物質(zhì)候選物選擇及純化

選用四川格純生物醫(yī)藥有限公司市售的黃豆黃素作為標準物質(zhì)候選物，使用烘箱和真空冷凍干燥機對樣品進行加熱和冷凍干燥除水后，使用卡爾費休庫倫滴定法確定樣品含水量為0.30%。初測液相純度大于99%。使用1.5 mL 棕色進樣小瓶對充分混勻的樣品，在潔凈、干燥的環(huán)境下[溫度(20±5) ℃，濕度(40±10)%進行分裝。每瓶樣品包裝量為20 mg，共分裝113個單元，分裝好的樣品貯存于干燥器內(nèi)，于(20±5) ℃下干燥避光保存。

2.2 定性分析

圖1 為黃豆黃素標準物質(zhì)候選物紅外光譜圖，對特征峰進行歸屬分析，主要特征吸收峰跟黃豆黃素結(jié)構(gòu)相符合。圖2為黃豆黃素標準物質(zhì)候選物的質(zhì)譜圖，主要碎片離子質(zhì)荷比(m/z)分別為285.1、270.1、242.2，與文獻[14]記載的定性離子對相符合，經(jīng)過分析可知，這些質(zhì)譜峰分別屬于[M+H]+、[M+H-OH]+和[M+H-CHO]+。

圖1 黃豆黃素標準物質(zhì)候選物的紅外光譜圖

圖2 黃豆黃素標準物質(zhì)候選物的質(zhì)譜圖

圖3 為黃豆黃素標準物質(zhì)候選物的核磁氫譜圖，典型的化學位移值均與黃豆黃素結(jié)構(gòu)相對應，分別為3.86×10-6對應于21 號C 上所連的氫；6.79×10-6～6.83×10-6對應于14、16 號碳上所連的氫；6.94×10-6對應于6 號碳上所連的氫；7.37×10-6～7.39×10-6對應于13、17 號碳上所連的氫；7.43×10-6對應于3 號碳上所連的氫；8.26×10-6對應于22 號C上所連的氫；9.50×10-6對應于18 號C 上所連的氫。經(jīng)紅外、質(zhì)譜和核磁多種定性手段分析，可以確認標準物質(zhì)候選物為黃豆黃素。

圖3 黃豆黃素標準物質(zhì)候選物的核磁氫譜圖

2.3 均勻性檢驗

按照1.2.3 方法進行黃豆黃素純度標準物質(zhì)均勻性檢驗，測量結(jié)果見表2。由表2數(shù)據(jù)計算得總標準偏差s=0.02，總平均值為99.19%，組間方差和為0.000 58，組內(nèi)方差和為0.000 35，F(xiàn)=1.64。查表知F0.05(10，22)=2.30，F(xiàn)＜F0.05(10，22)，表明當取樣量為5 mg時，樣品均勻性良好，因此，在本標準物質(zhì)研制項目中，黃豆黃素純度標準物質(zhì)以5 mg 作為最小取樣量。

表2 黃豆黃素純度標準物質(zhì)量值均勻性評定結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性檢驗

按照1.2.4方法，按照先密后疏的原則對黃豆黃素純度標準物質(zhì)穩(wěn)定性進行檢驗，表3和表4分別為長期穩(wěn)定性檢測結(jié)果和統(tǒng)計結(jié)果，表5和表6分別是短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果和統(tǒng)計結(jié)果。斜率β1和截距β0是對各個時間點檢測結(jié)果平均值擬合直線獲得，統(tǒng)計結(jié)果均顯示|β1|＜t0.95，3?s(β1)。所以判斷本標準物質(zhì)在設定的保存溫度下，12個月內(nèi)量值沒有趨勢性變化。在低于60 ℃的運輸條件下，7天內(nèi)可保證純度量值穩(wěn)定。

表3 黃豆黃素純度標準物質(zhì)長期穩(wěn)定性檢測結(jié)果

表4 黃豆黃素純度標準物質(zhì)長期穩(wěn)定性統(tǒng)計結(jié)果

表5 黃豆黃素純度標準物質(zhì)量值短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

表6 黃豆黃素純度標準物質(zhì)量值短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

2.5 純度定值

2.5.1 質(zhì)量平衡法純度定值

質(zhì)量平衡法按照式(1)對黃豆黃素純度標準物質(zhì)定值：

式中：PMB——樣品質(zhì)量分數(shù)；

P0——主成分質(zhì)量分數(shù)；

XW——水分質(zhì)量分數(shù)；

Xn——非揮發(fā)性雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)；

Xv——揮發(fā)性雜質(zhì)質(zhì)量分數(shù)[15]。

通過比較不同色譜柱、不同流動相、不同分析波長，確定最優(yōu)的檢測條件，主要包括采用Agilent Plus -C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)液相色譜柱，采用乙腈和0.15%磷酸水溶液作為流動相，流動相體積比為25：75，流量為1.0 mL/min，檢測波長選擇261 nm。將目標標準物質(zhì)樣品配制成500 mg/L 的甲醇溶液，在上述色譜條件下平行測定6次，得到主成分的質(zhì)量分數(shù)。

采用卡爾費休法進行水分測定，測定前采用固體水分標準物質(zhì)校準測量方法，對黃豆黃素水分含量進行6 次平行測定，每次取樣質(zhì)量為5～7 mg，因為是固體進樣，測量過程中開蓋容易引入空氣中的水分，造成測量不準確[16]，因此水分測定結(jié)果應扣除試驗過程中開蓋引入的空氣中水分值，該水分值采用模擬加樣過程測定獲得。

采用基于氫火焰檢測器的頂空氣相色譜法對揮發(fā)性雜質(zhì)進行測定，稱取20 mg 黃豆黃素于20 mL頂空瓶中，加入2 mL 二甲亞砜溶解，采用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、二甲苯、正己烷9種有機溶劑為揮發(fā)性雜質(zhì)的對照，用單點法定量。

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析黃豆黃素中23種常見元素含量，以元素含量之和作為不揮發(fā)性雜質(zhì)含量。

黃豆黃素純度標準物質(zhì)主成分、水分、有機揮發(fā)性雜質(zhì)、無機非揮發(fā)性雜質(zhì)含量測定及標準物質(zhì)定值結(jié)果列于表7。

表7 黃豆黃素純度標準物質(zhì)質(zhì)量平衡法純度(質(zhì)量分數(shù))定值結(jié)果%

2.5.2 定量核磁法純度定值

定量核磁法按照式(2)對黃豆黃素純度標準物質(zhì)定值[17]：

式中：PNMR——黃豆黃素質(zhì)量分數(shù)；

Ix——黃豆黃素定量峰的積分面積；

Istd——內(nèi)標物苯甲酸定量峰的積分面積；

nstd——內(nèi)標物苯甲酸化學式中定量峰對應的H原子數(shù)量；

nx——黃豆黃素在化學式中定量峰對應的H原子數(shù)量；

Mx——黃豆黃素的相對分子質(zhì)量；

Mstd——內(nèi)標物苯甲酸的相對分子質(zhì)量；

mstd——添加的內(nèi)標物苯甲酸的質(zhì)量，g；

mx——黃豆黃素的稱樣質(zhì)量，g；

Pstd——內(nèi)標物苯甲酸的純度(質(zhì)量分數(shù))。

為保證定量核磁法定值的準確性，針對氘代溶劑、內(nèi)標物、定量峰位置、激發(fā)脈沖角度、弛豫時間以及累計采樣次數(shù)進行了試驗，經(jīng)優(yōu)化確定定值用核磁條件：激發(fā)脈沖角度為30°，采樣時間為4.823 5 s，時間域數(shù)據(jù)點為64 K，掃描譜寬(SWH)為17.0×10-6，激發(fā)中心(O1P)為8.15×10-6，掃描寬度為6 793.478 Hz，弛豫延遲(D1)為13.99 s，偏置頻率為3 253.22 Hz，接收增益為322，探頭溫度為293.8 K，脈沖序列為zg30，累計采樣次數(shù)為128次，定量峰為8.36×10-6(Hz)和8.02×10-6(dt，J = 8.0，2.0 Hz)。定量核磁法對黃豆黃素純度標準物質(zhì)6 次定值結(jié)果均值為99.13%，標準偏差為0.023%。

按照JJF 1855—2020 要求，對不同的定值結(jié)果應采用F檢驗進行等精度檢驗，然后再采用t檢驗進行平均值一致性檢驗，本研究中，兩種定值方法的結(jié)果均通過了F和t檢驗，說明兩種方法等精度且平均值一致，因此，黃豆黃素純度標準物質(zhì)的量值以兩種定值結(jié)果的平均值表示，最終定值結(jié)果為99.1%。

2.6 定值不確定度

黃豆黃素純度標準物質(zhì)的定值不確定度主要來源于：(1)樣品均勻性；(2)樣品穩(wěn)定性；(3)定值方法。表8列出了各不確定度分量，將表8數(shù)據(jù)合成，得到定值結(jié)果的相對標準不確定度urel=0.15%，取包含因子k=2，則相對擴展不確定度Urel=k·urel=0.3%，擴展不確定度為0.3%，定值結(jié)果為(99.1±0.3)%。

表8 黃豆黃素標準物質(zhì)不確定度評定結(jié)果

3 結(jié)語

采用三種方法對經(jīng)純化處理后的黃豆黃素標準物質(zhì)進行定性分析，并確證樣品。采用兩種不同原理的方法對標準物質(zhì)進行純度定值，采用質(zhì)量平衡法進行均勻性檢驗和穩(wěn)定性檢驗，并對定值結(jié)果的不確定度進行了系統(tǒng)評定。研制的黃豆黃素純度標準物質(zhì)已經(jīng)成功申報國家一級標準物質(zhì)。