李光澤 張濟 林昌儉 王垚柯 俞慎林

下肢動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans,ASO)是因形成下肢動脈粥樣斑塊,阻塞血管,導致下肢供血不足,最終全身動脈硬化病變[1]。介入治療可有效再通狹窄或閉塞血管,但介入術后血管再狹窄一直是臨床難以解決的難題。血管再狹窄的具體發(fā)生機制可能與炎癥反應、血管內皮損傷、血栓形成等多種原因相關,且血管炎癥反應是ASO介入術后血管再狹窄的重要原因之一[2]。李立濤等[3]研究發(fā)現(xiàn),ASO介入術后再狹窄病人血清內皮素-1(endothelin-1,ET-1)水平升高,并可能與術后狹窄形成相關。李全成等[4]研究發(fā)現(xiàn),術前高敏C反應蛋白(high-sensitive C-reactive protein,hs-CRP)水平升高也是ASO介入術后再狹窄的危險因素。ASO的病理基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),而高遷移率蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)及Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)途徑可能通過免疫炎癥反應參與AS的發(fā)生發(fā)展[5]。本文研究HMGB1/TLR4信號通路是否也參與ASO介入術后血管再狹窄,并分析該通路與血管炎癥相關因子ET-1及hs-CRP之間的關系。

對象與方法

一、對象

我院2020年1月～2021年1月間收治的84例,共96條病變血管行介入治療的ASO病人納為研究對象。納入標準:所有病人均符合下肢動脈硬化閉塞癥治療指南(中華醫(yī)學會外科學分會血管外科學組,2008年版)中相關診斷標準[6];年齡≥60歲;經(jīng)下肢血管造影(DSA)或CT血管成像(CTA)證實下肢動脈狹窄程度≥50%;均為首次行介入術治療;術后可配合完成隨訪。排除標準:合并大動脈炎活動期;合并重要器官功能嚴重障礙;精神異常;嚴重凝血功能障礙;因栓子脫落的急性下肢動脈缺血。84例ASO病人中,男50例,女34例,年齡60～77歲,平均年齡(64.54±10.63)歲。36例病人接受球囊擴張術,30例病人接受支架形成術,18例病人接受球囊擴張+支架形成術。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,參與者均知情且同意。

二、方法

1.手術方法:根據(jù)術前CTA影像學資料評估血管情況,選擇合適的入路,以Seldinger技術穿刺動脈置入鞘管后靜脈給予0.5～1.0 mg/kg肝素進行全身肝素化,放入超滑導絲并跟進導管,從腹主動脈開始行雙側髂動脈及患側肢體動脈造影,根據(jù)血管病變情況決定手術方式。造影后將導絲導管通過狹窄或閉塞部位,交換超硬導絲,造影后根據(jù)病變情況選擇不同直徑球囊擴張狹窄或閉塞部位,對髂動脈病變多者考慮置放支架,股動脈病變者根據(jù)球囊擴張后有無遺留狹窄及夾層等情況選擇性置放支架。

2.外周血單個核細胞(PBMCs)的HMGB1/TLR4 mRNA水平檢測:(1)PBMCs分離:分別于術前及術后1個月,采集所有病人空腹肘靜脈血1 ml,抗凝試管收集,使用外周血單個核細胞分離試劑盒(北京索萊寶)分離單個核細胞。具體操作如下:1 ml外周血與1 ml生理鹽水混合均勻后,每分鐘4 000 r離心20分鐘,溶液從上到下分為分為血漿層、乳白色PBMCs層、透明分離液層及紅細胞層,收集PBMCs至5 ml生理鹽水中,每分鐘4 000 r離心20分鐘,取沉淀洗滌2次,得到PBMCs。(2)逆轉錄實時熒光定量PCR(qRT-PCR):使用Trizol試劑提取PBMCs細胞總RNA,用cDNAiScriptTM合成試劑盒進行RNA反轉錄成cDNA。采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM對cDNA進行RT-PCR反應,實驗設定的反應溫度與時間如下:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火,延伸40 s,40個循環(huán),RT-PCR引物序列如下,HMGB1上游引物:5'-TGCAGATGACAAGCAGCCTT-3';HMGB1下游引物:5'-GCTGCATCAGGCTTTC CTTT-3';TLR4 上游引物:5'-TCCGACGGCCGTCTGCTCGC-3';TLR4 下游引物:5'-TACGGATAGTAGCTGGCCAGCC-3';GAPDH上游引物:5'-TGCCAAATATGATGAC ATCAAGAA-3';GAPDH下游引物:5'-GGAGTGGGTGTCGCTGTTG-3'。利用2-△△Ct方法分析結果,以GAPDH作為內參,將每組所測得的目的基因cDNA拷貝數(shù)與其相應的內參相比,得出目標基因的相對含量,上述實驗重復3次。

3.觀察及隨訪:低分子肝素抗凝3～5天,氯吡格雷口服半年,阿司匹林終生服用。術后行CTA檢查,病變血管殘余狹窄<30%,無動脈夾層存在即為成功。術后隨訪12個月,行雙下肢彩超了解靶血管通暢情況,對臨床癥狀嚴重者行雙下肢CTA檢查,血管狹窄≥50%定義為血管再狹窄或復發(fā)。

三、統(tǒng)計學方法

結果

1.ASO介入治療術后復發(fā)情況:介入治療后,84例病人96條病變血管均開通,隨訪12個月(無病例丟失),經(jīng)雙下肢超聲及CTA檢查提示有16例病人(共18條病變血管)再狹窄,其中髂動脈病變病人7條,股腘動脈病變病人11條。將16例復發(fā)者納為復發(fā)組,剩余68例病人納為對照組。

2.兩組病人一般資料比較:兩組性別、年齡、基礎性疾病及住院時間等一般資料進行比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組病人一般資料比較

3. 兩組病人HMGB1/TLR4表達水平:復發(fā)組病人PBMCs內HMGB1及TLR4表達水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。復發(fā)組HMGB1的相對表達水平為1.26±0.19,對照組HMGB1的相對表達水平為0.52±0.03,兩組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);復發(fā)組TLR4的相對表達水平為2.57±0.22,對照組TLR4的相對表達水平為0.29±0.02,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A.HGMB1 mRNA;B.TLR4 mRNA (**表示P<0.01)

4.兩組ET-1及hs-CRP水平比較見圖2。復發(fā)組病人血清ET-1及hs-CRP水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復發(fā)組血清ET-1水平為(76.95±13.68)pg/ml,對照組為(63.15±12.07)pg/ml,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);復發(fā)組血清hs-CRP水平為(6.79±1.92)mg/L,對照組為(3.94±1.54)mg/L,兩組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A.ET-1;B.hsCRP(**表示P<0.01)

5. HMGB1/TLR4水平與ET-1、hs-CRP關系分析見表2。相關性分析提示,復發(fā)組病人外周血PBMCs的HMGB1及TLR4水平與血清的ET-1及hs-CRP水平均呈正相關(P<0.05)。

表2 復發(fā)組病人PBMCs的HMGB1/TLR4與ET-1、hs-CRP的關系分析

討論

目前,以球囊擴張及支架置入為主要代表的介入治療已成為目前ASO治療的主流。有研究顯示,介入術后3年,下肢動脈狹窄及閉塞動脈病人血管再狹窄率分別為39%和52%,嚴重狹窄及閉塞病人3年復發(fā)率更高[7]。體內置入支架后,會導致局部血小板聚集,引起炎癥反應和血栓形成;同時,損傷的血管周圍有大量白細胞聚集,會導致炎癥反應,使平滑肌細胞遷移和增殖,引起內膜增生,發(fā)生再狹窄[8]。本研究對84例行介入治療的ASO病人進行為期1年的隨訪,經(jīng)CTA檢查證實術后1年內有16例病人出現(xiàn)再狹窄,再狹窄發(fā)生率為19.05%。

介入術后再狹窄所涉及的原因及機制復雜,其中血管內皮損傷及炎癥反應是最主要的機制之一。血管內皮細胞產(chǎn)生和釋放收縮(內皮素,ET-1)和舒張因子(一氧化氮,NO),以上因子在生理狀態(tài)下保持動態(tài)平衡,從而維持正常的血管張力和血流量。ET-1是一種活性多肽,由內皮細胞合成及分泌,可刺激平滑肌收縮,也是重要的血管損傷因子[9]。有研究表示,內外界作用對血管的牽拉及刺激,均可促進內皮細胞分泌更多的ET-1,導致血管收縮及狹窄[10]。置入支架可損傷血管內皮細胞,導致ET-1水平升高可預測血管再狹窄的發(fā)生[11]。hs-CRP是炎癥反應的敏感標志物,hs-CRP水平升高提示機體炎癥反應,hs-CRP也參與ASO的發(fā)生及發(fā)展[12]。李全成等[4]研究表明,hs-CRP水平升高是ASO病人介入術治療后復發(fā)的危險因素。本研究發(fā)現(xiàn),ASO復發(fā)者血清hs-CRP水平高于未復發(fā)者,提示hs-CRP也可能參與介入術后血管再狹窄。

HMGB1是HMGB家族中的一員,在多種器官及細胞中表達,可與DNA結合,參與DNA修復、基因轉錄、細胞復制等生命活動。TLR4屬于TLRs家族,TLR4能識別內外源性配體,參與多種病理過程。有研究表示,HMGB1與TLR4結合后,可活化髓樣分化蛋88(MyD88)及Toll/IL-1受體結構域銜接蛋白,活化NF-κΒ,激活炎癥反應,參與AS的發(fā)生發(fā)展[13]。據(jù)報道,hs-CRP可以激活和促進HMGB1的釋放,且在急性冠脈綜合征病人血清HMGB1與hs-CRP存在正相關性,均是反映炎癥程度重要指標[14]。冠心病病人血清HMGB1與ET-1水平成顯著正相關,且可反映病人體內炎癥水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組未復發(fā)病人相比,介入術后復發(fā)ASO病人外周血PBMCs內HMGB1及TLR4表達量更高,提示HMGB1/TLR4信號通路可能參與介入術后復發(fā)。相關性分析發(fā)現(xiàn),介入術后復發(fā)病人外周血PBMCs的HMGB1及TLR4表達量與血管損傷因子ET-1及炎癥因子hs-CRP水平間均呈正相關。提示HMGB1/TLR4信號通路可能通過激活炎癥因子釋放,促進血管損傷,進而參與ASO病人介入術后復發(fā)。

本研究存在以下局限性:首先,本研究對HMGB1/TLR4信號通路的檢測受條件限制僅基于外周血PBMCs,缺乏病變部位的直接標本;其次,所獲的結果僅為相關性,并不能明確其機制及因果聯(lián)系;最后,本研究未能收集病人手術前的標本,HMGB1/TLR4以及ET-1、hsCRP水平的變化還存在較多混雜因素。

綜上所述,HMGB1/TLR4信號通路可能通過激活炎癥因子釋放,促進血管損傷,進而參與ASO病人介入術后復發(fā)。