李光澤 張濟(jì) 林昌儉 王垚柯 俞慎林

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans,ASO)是因形成下肢動(dòng)脈粥樣斑塊,阻塞血管,導(dǎo)致下肢供血不足,最終全身動(dòng)脈硬化病變[1]。介入治療可有效再通狹窄或閉塞血管,但介入術(shù)后血管再狹窄一直是臨床難以解決的難題。血管再狹窄的具體發(fā)生機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷、血栓形成等多種原因相關(guān),且血管炎癥反應(yīng)是ASO介入術(shù)后血管再狹窄的重要原因之一[2]。李立濤等[3]研究發(fā)現(xiàn),ASO介入術(shù)后再狹窄病人血清內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)水平升高,并可能與術(shù)后狹窄形成相關(guān)。李全成等[4]研究發(fā)現(xiàn),術(shù)前高敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitive C-reactive protein,hs-CRP)水平升高也是ASO介入術(shù)后再狹窄的危險(xiǎn)因素。ASO的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),而高遷移率蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)及Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)途徑可能通過(guò)免疫炎癥反應(yīng)參與AS的發(fā)生發(fā)展[5]。本文研究HMGB1/TLR4信號(hào)通路是否也參與ASO介入術(shù)后血管再狹窄,并分析該通路與血管炎癥相關(guān)因子ET-1及hs-CRP之間的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

我院2020年1月～2021年1月間收治的84例,共96條病變血管行介入治療的ASO病人納為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):所有病人均符合下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥治療指南(中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)血管外科學(xué)組,2008年版)中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];年齡≥60歲;經(jīng)下肢血管造影(DSA)或CT血管成像(CTA)證實(shí)下肢動(dòng)脈狹窄程度≥50%;均為首次行介入術(shù)治療;術(shù)后可配合完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):合并大動(dòng)脈炎活動(dòng)期;合并重要器官功能嚴(yán)重障礙;精神異常;嚴(yán)重凝血功能障礙;因栓子脫落的急性下肢動(dòng)脈缺血。84例ASO病人中,男50例,女34例,年齡60～77歲,平均年齡(64.54±10.63)歲。36例病人接受球囊擴(kuò)張術(shù),30例病人接受支架形成術(shù),18例病人接受球囊擴(kuò)張+支架形成術(shù)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),參與者均知情且同意。

二、方法

1.手術(shù)方法:根據(jù)術(shù)前CTA影像學(xué)資料評(píng)估血管情況,選擇合適的入路,以Seldinger技術(shù)穿刺動(dòng)脈置入鞘管后靜脈給予0.5～1.0 mg/kg肝素進(jìn)行全身肝素化,放入超滑導(dǎo)絲并跟進(jìn)導(dǎo)管,從腹主動(dòng)脈開始行雙側(cè)髂動(dòng)脈及患側(cè)肢體動(dòng)脈造影,根據(jù)血管病變情況決定手術(shù)方式。造影后將導(dǎo)絲導(dǎo)管通過(guò)狹窄或閉塞部位,交換超硬導(dǎo)絲,造影后根據(jù)病變情況選擇不同直徑球囊擴(kuò)張狹窄或閉塞部位,對(duì)髂動(dòng)脈病變多者考慮置放支架,股動(dòng)脈病變者根據(jù)球囊擴(kuò)張后有無(wú)遺留狹窄及夾層等情況選擇性置放支架。

2.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的HMGB1/TLR4 mRNA水平檢測(cè):(1)PBMCs分離:分別于術(shù)前及術(shù)后1個(gè)月,采集所有病人空腹肘靜脈血1 ml,抗凝試管收集,使用外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒(北京索萊寶)分離單個(gè)核細(xì)胞。具體操作如下:1 ml外周血與1 ml生理鹽水混合均勻后,每分鐘4 000 r離心20分鐘,溶液從上到下分為分為血漿層、乳白色PBMCs層、透明分離液層及紅細(xì)胞層,收集PBMCs至5 ml生理鹽水中,每分鐘4 000 r離心20分鐘,取沉淀洗滌2次,得到PBMCs。(2)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR):使用Trizol試劑提取PBMCs細(xì)胞總RNA,用cDNAiScriptTM合成試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM對(duì)cDNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),實(shí)驗(yàn)設(shè)定的反應(yīng)溫度與時(shí)間如下:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火,延伸40 s,40個(gè)循環(huán),RT-PCR引物序列如下,HMGB1上游引物:5'-TGCAGATGACAAGCAGCCTT-3';HMGB1下游引物:5'-GCTGCATCAGGCTTTC CTTT-3';TLR4 上游引物:5'-TCCGACGGCCGTCTGCTCGC-3';TLR4 下游引物:5'-TACGGATAGTAGCTGGCCAGCC-3';GAPDH上游引物:5'-TGCCAAATATGATGAC ATCAAGAA-3';GAPDH下游引物:5'-GGAGTGGGTGTCGCTGTTG-3'。利用2-△△Ct方法分析結(jié)果,以GAPDH作為內(nèi)參,將每組所測(cè)得的目的基因cDNA拷貝數(shù)與其相應(yīng)的內(nèi)參相比,得出目標(biāo)基因的相對(duì)含量,上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.觀察及隨訪:低分子肝素抗凝3～5天,氯吡格雷口服半年,阿司匹林終生服用。術(shù)后行CTA檢查,病變血管殘余狹窄<30%,無(wú)動(dòng)脈夾層存在即為成功。術(shù)后隨訪12個(gè)月,行雙下肢彩超了解靶血管通暢情況,對(duì)臨床癥狀嚴(yán)重者行雙下肢CTA檢查,血管狹窄≥50%定義為血管再狹窄或復(fù)發(fā)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

1.ASO介入治療術(shù)后復(fù)發(fā)情況:介入治療后,84例病人96條病變血管均開通,隨訪12個(gè)月(無(wú)病例丟失),經(jīng)雙下肢超聲及CTA檢查提示有16例病人(共18條病變血管)再狹窄,其中髂動(dòng)脈病變病人7條,股腘動(dòng)脈病變病人11條。將16例復(fù)發(fā)者納為復(fù)發(fā)組,剩余68例病人納為對(duì)照組。

2.兩組病人一般資料比較:兩組性別、年齡、基礎(chǔ)性疾病及住院時(shí)間等一般資料進(jìn)行比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組病人一般資料比較

3. 兩組病人HMGB1/TLR4表達(dá)水平:復(fù)發(fā)組病人PBMCs內(nèi)HMGB1及TLR4表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。復(fù)發(fā)組HMGB1的相對(duì)表達(dá)水平為1.26±0.19,對(duì)照組HMGB1的相對(duì)表達(dá)水平為0.52±0.03,兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);復(fù)發(fā)組TLR4的相對(duì)表達(dá)水平為2.57±0.22,對(duì)照組TLR4的相對(duì)表達(dá)水平為0.29±0.02,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.HGMB1 mRNA;B.TLR4 mRNA (**表示P<0.01)

4.兩組ET-1及hs-CRP水平比較見(jiàn)圖2。復(fù)發(fā)組病人血清ET-1及hs-CRP水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)發(fā)組血清ET-1水平為(76.95±13.68)pg/ml,對(duì)照組為(63.15±12.07)pg/ml,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);復(fù)發(fā)組血清hs-CRP水平為(6.79±1.92)mg/L,對(duì)照組為(3.94±1.54)mg/L,兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.ET-1;B.hsCRP(**表示P<0.01)

5. HMGB1/TLR4水平與ET-1、hs-CRP關(guān)系分析見(jiàn)表2。相關(guān)性分析提示,復(fù)發(fā)組病人外周血PBMCs的HMGB1及TLR4水平與血清的ET-1及hs-CRP水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。

表2 復(fù)發(fā)組病人PBMCs的HMGB1/TLR4與ET-1、hs-CRP的關(guān)系分析

討論

目前,以球囊擴(kuò)張及支架置入為主要代表的介入治療已成為目前ASO治療的主流。有研究顯示,介入術(shù)后3年,下肢動(dòng)脈狹窄及閉塞動(dòng)脈病人血管再狹窄率分別為39%和52%,嚴(yán)重狹窄及閉塞病人3年復(fù)發(fā)率更高[7]。體內(nèi)置入支架后,會(huì)導(dǎo)致局部血小板聚集,引起炎癥反應(yīng)和血栓形成;同時(shí),損傷的血管周圍有大量白細(xì)胞聚集,會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng),使平滑肌細(xì)胞遷移和增殖,引起內(nèi)膜增生,發(fā)生再狹窄[8]。本研究對(duì)84例行介入治療的ASO病人進(jìn)行為期1年的隨訪,經(jīng)CTA檢查證實(shí)術(shù)后1年內(nèi)有16例病人出現(xiàn)再狹窄,再狹窄發(fā)生率為19.05%。

介入術(shù)后再狹窄所涉及的原因及機(jī)制復(fù)雜,其中血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)是最主要的機(jī)制之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放收縮(內(nèi)皮素,ET-1)和舒張因子(一氧化氮,NO),以上因子在生理狀態(tài)下保持動(dòng)態(tài)平衡,從而維持正常的血管張力和血流量。ET-1是一種活性多肽,由內(nèi)皮細(xì)胞合成及分泌,可刺激平滑肌收縮,也是重要的血管損傷因子[9]。有研究表示,內(nèi)外界作用對(duì)血管的牽拉及刺激,均可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌更多的ET-1,導(dǎo)致血管收縮及狹窄[10]。置入支架可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致ET-1水平升高可預(yù)測(cè)血管再狹窄的發(fā)生[11]。hs-CRP是炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)志物,hs-CRP水平升高提示機(jī)體炎癥反應(yīng),hs-CRP也參與ASO的發(fā)生及發(fā)展[12]。李全成等[4]研究表明,hs-CRP水平升高是ASO病人介入術(shù)治療后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。本研究發(fā)現(xiàn),ASO復(fù)發(fā)者血清hs-CRP水平高于未復(fù)發(fā)者,提示hs-CRP也可能參與介入術(shù)后血管再狹窄。

HMGB1是HMGB家族中的一員,在多種器官及細(xì)胞中表達(dá),可與DNA結(jié)合,參與DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞復(fù)制等生命活動(dòng)。TLR4屬于TLRs家族,TLR4能識(shí)別內(nèi)外源性配體,參與多種病理過(guò)程。有研究表示,HMGB1與TLR4結(jié)合后,可活化髓樣分化蛋88(MyD88)及Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白,活化NF-κΒ,激活炎癥反應(yīng),參與AS的發(fā)生發(fā)展[13]。據(jù)報(bào)道,hs-CRP可以激活和促進(jìn)HMGB1的釋放,且在急性冠脈綜合征病人血清HMGB1與hs-CRP存在正相關(guān)性,均是反映炎癥程度重要指標(biāo)[14]。冠心病病人血清HMGB1與ET-1水平成顯著正相關(guān),且可反映病人體內(nèi)炎癥水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組未復(fù)發(fā)病人相比,介入術(shù)后復(fù)發(fā)ASO病人外周血PBMCs內(nèi)HMGB1及TLR4表達(dá)量更高,提示HMGB1/TLR4信號(hào)通路可能參與介入術(shù)后復(fù)發(fā)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),介入術(shù)后復(fù)發(fā)病人外周血PBMCs的HMGB1及TLR4表達(dá)量與血管損傷因子ET-1及炎癥因子hs-CRP水平間均呈正相關(guān)。提示HMGB1/TLR4信號(hào)通路可能通過(guò)激活炎癥因子釋放,促進(jìn)血管損傷,進(jìn)而參與ASO病人介入術(shù)后復(fù)發(fā)。

本研究存在以下局限性:首先,本研究對(duì)HMGB1/TLR4信號(hào)通路的檢測(cè)受條件限制僅基于外周血PBMCs,缺乏病變部位的直接標(biāo)本;其次,所獲的結(jié)果僅為相關(guān)性,并不能明確其機(jī)制及因果聯(lián)系;最后,本研究未能收集病人手術(shù)前的標(biāo)本,HMGB1/TLR4以及ET-1、hsCRP水平的變化還存在較多混雜因素。

綜上所述,HMGB1/TLR4信號(hào)通路可能通過(guò)激活炎癥因子釋放,促進(jìn)血管損傷,進(jìn)而參與ASO病人介入術(shù)后復(fù)發(fā)。