曾文丹　陸柳英　施平麗　肖亮　尚小紅　曹升　吳正丹　嚴華兵

關鍵詞：木薯；同源四倍體；鑒定；種質創(chuàng)新

中圖分類號：S31 文獻標識碼：A

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，是一種富含淀粉的塊根作物，有“淀粉之王”、“地下糧倉”等美稱。木薯不僅是重要的非主糧生物質能源作物，也是重要的經濟作物，用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業(yè)產品，如淀粉、酒精等[1-2]。然而，中國木薯產業(yè)目前存在種植品種單一、單產低、淀粉含量低和比較經濟效益低等突出問題[3]，多倍化可伴隨產生一些優(yōu)良的農藝性狀，如抗逆性增強、器官體積變大、生物量增加等，被廣泛應用于培育植物新品種[4-6]。如印度三倍體木薯品種Sree Harsha 在株型、塊根產量、淀粉含量、抗性方面均優(yōu)于二倍體親本[7]；在巴西，NASSAR 的研究團隊通過秋水仙素誘導染色體加倍、遠緣雜交等技術，獲得了優(yōu)良的木薯多倍體，如UnB201、UnB310 在長勢、塊根產量、蛋白質含量等方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[8-9]。因此，多倍體育種為木薯品種培育提供了一個重要途徑。

本研究以木薯品種SC12 為對象，探討不同濃度秋水仙素對木薯組培苗誘導率的影響，并對二倍體與同源四倍體組培苗及大田材料進行形態(tài)學、解剖學和農藝性狀比較。以期為提升木薯產量并創(chuàng)制新種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SC12 木薯組培苗來自廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院經濟作物研究所。

1.2 方法

1.2.1 木薯同源四倍體離體誘導 以無菌水處理作為對照，將木薯組培苗的單芽莖段用0.03～0.20 g/L 的秋水仙素溶液，避光震蕩培養(yǎng)48 h 后，用無菌水沖洗4 次，轉接到MS+0.02 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖+6.3 g/L 瓊脂的繼代培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強度為18.75～25.00 mol/（m·s），光照時間16 h/d。45 d 后，統(tǒng)計各濃度下的莖段成活率。各處理設3 個重復，每個重復接種10 瓶，每瓶接種3 株。

1.2.2 倍性鑒定 流式細胞儀鑒定：通過形態(tài)學初步觀察，篩選葉色加深、葉片變寬等具有四倍體形態(tài)學特性的植株進行流式細胞儀倍性檢測，檢測方法參考ZHOU 等[10]的方法。染色體壓片鑒定：檢測方法參考周慧文[11]的壓片方法，待組培苗根尖長至1～2 cm 時，取幼嫩生長旺盛的根尖，將其浸泡在0.002 mol/L 八羥基喹啉∶0.1%秋水仙素溶液1∶1 的溶液中，進行預處理。隨后用卡諾固定液固定20 h。于高滲溶液（0.075 mol/LKCl）浸泡30 min 后用2.5%纖維素酶與2.5%果膠酶1∶1 混合酶液處理根尖8 h，蒸餾水洗凈后用卡寶品紅染色5 min。用光學顯微鏡觀察根尖體細胞染色體數。

1.2.3 二倍體與同源四倍體離體觀察比較 將鑒定為同源四倍體的木薯組培苗株系（SC12-4、SC12-11）與二倍體對照接種至MS+0.02 mg/LNAA+20 g/L 蔗糖+6.3 g/L 瓊脂的生根培養(yǎng)基上。30 d 后統(tǒng)計組培苗的株高、莖粗、葉厚、裂葉長、裂葉寬、葉綠素SPAD 值等。各處理設3 個重復，每個重復接種15 瓶，每瓶接種6 株。

1.2.4 二倍體與同源四倍體形態(tài)觀察比較 將鑒定為同源四倍體的木薯組培苗株系（SC12-4、SC12-11）與二倍體組培苗移栽大棚煉苗后移栽至大田，觀察不同倍性植株移栽大田60 d（苗期）、120 d（塊根形成期）、180 d（塊根膨大期）、240 d（成熟期）的生長情況。統(tǒng)計不同時期植株的株高、莖粗、葉厚、裂葉長、裂葉寬、葉綠素SPAD值；成熟期的單株薯種、地上部重、收獲指數。各處理設3 個重復，每個重復9 株。收獲指數=單株薯種/（單株薯種+地上部重）。

1.2.5 二倍體與四倍體解剖學觀察比較 保衛(wèi)細胞觀察：選取二倍體與四倍體木薯株系（SC12-4、SC12-11）成熟葉片，將葉片下表皮朝上放置。用鑷子撕取葉片下表皮置于載玻片上，滴一滴0.5%的碘–碘化鉀溶液，染色30～60 s 后覆上蓋玻片。使用光學顯微鏡Olympus BH-2 型40×物鏡觀察并拍照，測量保衛(wèi)細胞長、寬，對保衛(wèi)細胞內葉綠體數目進行計數，并對一個視野內保衛(wèi)細胞個數進行計數。每個倍性統(tǒng)計5 株，每株觀察測量30 個保衛(wèi)細胞。

葉片橫切面：采用番紅固綠染色法觀察木薯二倍體及同源四倍體的葉片橫截面，用光學顯微鏡觀察并拍照，測量葉片橫截面、柵欄組織和海綿組織厚度。

葉片組織緊密度（CTR）=柵欄組織厚度（PPT）/葉片厚度

葉片組織疏松度（SR）=海綿組織厚度（SPT）/葉片厚度

1.3 數據處理

采用SPSS 18.0 和Excel 2010 軟件對數據進行處理與統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 木薯同源四倍體誘導

經秋水仙素浸泡處理的木薯單芽莖段15 d 左右開始萌發(fā)，隨著秋水仙素濃度的升高，單芽莖段的存活率降低，0.03%的秋水仙素處理48 h 后，單芽莖段的成活率為42.2%；當秋水仙素濃度升至0.10 g/L 時，存活率僅為8.9%；濃度升至0.20 g/L 時，單芽莖段無一存活（表1）。

2.2 木薯誘變材料的倍性鑒定

共得到存活組培苗74 株，其中38 株存在葉片異形、黃化、顏色變深、葉尖鈍化、葉片變寬等不同程度的形態(tài)變異。從中挑選疑似四倍體的組培苗進行繼代增殖，每一株組培苗的繼代植株作為一個株系，每次均挑選疑似四倍體的變異植株進行繼代。繼代4 次后，一共獲得20 個株系進行流式細胞儀檢測，在同一參數下，二倍體植株在熒光強度6750 處出現(xiàn)1 個主峰（圖1A），四倍體植株在熒光強度13 500 處出現(xiàn)1 個主峰（圖1B），四倍體植株的DNA 相對含量是二倍體的2倍。除二倍體植株和四倍體植株，通過流式細胞儀鑒定還檢測到多種嵌合體植株（圖1C、圖1D）。其中，11 個株系為同源四倍體，5 個株系為嵌合體，4 個株系為二倍體。同源四倍體為檢測株系的55%，為74 個存活株系的21.62%，即加倍率為21.62%。

根據流式細胞檢測結果，將鑒定為四倍體的株系進行細胞學鑒定，結果表明二倍體植株的根尖細胞染色體數目均為2n=2x=36，而四倍體植株根尖細胞染色體數目為2n=4x=72。

2.3 二倍體與同源四倍體株系組培苗觀察比較

繼代培養(yǎng)30 d 后，二倍體與四倍體不同株系植株生長情況如表2 所示。二倍體組培苗的株高、裂葉長、裂葉長/裂葉寬顯著高于四倍體組培苗，而裂葉寬、葉綠素SPAD 值、植株鮮重、干重顯著低于四倍體，說明四倍體組培苗相比二倍體植株矮壯、葉片濃綠、干物質積累多，生長勢較旺盛。

2.4 二倍體與同源四倍體大田植株形態(tài)觀察比較

將鑒定為四倍體的木薯組培苗株系（SC12-4、SC12-11）與二倍體組培苗移栽至大田，并于植后60 d（苗期）、120 d（塊根形成期）、180 d（塊根膨大期）、240 d（成熟期）對生長情況進行調查。如圖2 所示，不同時期的多倍體的株高低于二倍體，但差異不顯著；多倍體的裂葉寬顯著高于二倍體，裂葉長顯著低于二倍體，裂葉長/裂葉寬顯著降低，在葉片形態(tài)上表現(xiàn)為葉尖盾化，葉片由披針形向拱形過渡；大田生長的四倍體均呈現(xiàn)葉片厚、莖桿粗和葉色深等性狀，與四倍體組培苗植株表現(xiàn)一致。四倍體株系SC12-11 的單株塊根產量和收獲指數較高，分別為3.30 kg 和0.43，顯著高于二倍體株系（圖3）。

2.5 二倍體與四倍體解剖學觀察比較

與二倍體對照材料相比，變異四倍體葉片保衛(wèi)細胞長、寬、葉綠體數目均顯著增加，分別比二倍體增加2.33%、28.99%、117.79%；氣孔數顯著降低，比對照減少40.06%（表3）；四倍體變異株保衛(wèi)細胞呈橢圓形，二倍體保衛(wèi)細胞趨近于圓柱形（圖4）。葉片橫截面觀察結果表明（表4），四倍體葉片厚度和PPT 均顯著高于二倍體，比對照分別增加24.41%、43.88%；SPT 比對照顯著降低，降低了22.33%；PPT/SPT 是對照的1.9 倍。四倍體葉片的組織緊密度（CTR）為0.61 高于二倍體（0.52），葉片組[織疏松度（SR）為0.41 顯著低于二倍體（0.25），說明四倍體葉片的柵欄組織排列緊密，但海綿組織不發(fā)達。

3 討論

多倍體植物因其遺傳物質倍增，從而表現(xiàn)出植株生長健壯、器官變大、抗逆性增強、營養(yǎng)物質和代謝物含量增多的特性，因此多倍體誘導在種質資源創(chuàng)新方面發(fā)揮著重要作用[12-13]。雷美艷等[14]經過3 a 的栽培試驗均發(fā)現(xiàn)，百合多倍體株系JD-h-12 和JD-h-15 平均鱗莖重量優(yōu)于對照；懷地黃同源四倍體的2 個株系分別比二倍體親本增產26.6％和56.7％[15]；紫雛菊四倍體株系不僅菊苣酸含量較二倍體親本高，而且生物學產量也增加[16]。潞黨參的多倍體株系LDSS-5 與二倍體相比，塊根產量增加了76.0%，其葉、花、莖、種子及多糖含量均表現(xiàn)出巨大性或優(yōu)異性[17]。但是，木薯品種新選048 和華南8 號的四倍體單株的淀粉含量及鮮薯產量均低于二倍體親本[18]。本研究僅發(fā)現(xiàn)2 個四倍體株系的單株薯種比二倍體親本顯著增加。張曉霞等[19]對16 個白花除蟲菊同源四倍體和二倍體的農藝性狀進行比較分析，發(fā)現(xiàn)11個株系的總除蟲菊酯含量高于二倍體株系，僅有7 個株系干花中的總除蟲菊酯含量高于1.4%，研究結果與本研究結果一致。因此，考查四倍體的農藝性狀需要對所獲得的株系材料均進行鑒定評價，否則試驗結果可能出現(xiàn)偏差。

只有在一定的處理濃度范圍內，秋水仙素才能有效誘導多倍體發(fā)生。不同的基因型之間，適宜的誘變劑濃度和處理時間存在差異。聶楊眉[20]利用秋水仙素對5 個木薯品種的無菌腋芽進行誘導處理，0.5 g/L 的秋水仙素濃度處理SC5 6～9 h時，誘導率最高，可達66.67%，而0.1 g/L 的秋水仙素濃度處理6～9 h 為NZ199 最佳誘導濃度，但誘導率僅為16.67%；周慧文等[21]認為0.05～0.1 g/L 是誘導木薯組培苗單芽莖段獲得四倍體的最宜濃度范圍。本研究表明，木薯品種SC12 對秋水仙素較為敏感，當秋水仙素濃度為0.03 g/L時，成活率為42.4%，四倍體誘導率最高；當秋水仙素濃度提升到0.05 g/L 時， 成活率僅為19.4%。不同木薯品種最適宜的秋水仙素處理濃度范圍差異顯著。

CHEN 等[22]發(fā)現(xiàn)四倍體蘆筍的氣孔密度約為二倍體的一半，而葉綠體數量是二倍體的2 倍，以及氣孔長度和寬度略大于二倍體植株。董一昕等[23]也發(fā)現(xiàn)四倍體艾納香植株葉片保衛(wèi)細胞長和寬，均較二倍體差異顯著或極顯著。草棉二倍體、三倍體以及四倍體通過細胞學鑒定發(fā)現(xiàn)，隨著倍性的增加，氣孔密度呈下降趨勢，而氣孔長度和葉綠體數均呈上升趨勢[24]。本研究發(fā)現(xiàn)木薯變異四倍體葉片保衛(wèi)細胞長、寬、葉綠體數目均顯著增加，分別比二倍體增加2.33%、28.99%、117.79% ； 氣孔密度顯著降低， 比對照減少40.06%。本研究結果和前人[25-26]研究結果一致。所以氣孔密度、保衛(wèi)細胞的長度和葉綠體數目也是鑒定植株倍性的重要依據，該方法易取材，損傷小，操作簡單。

葉片的組織結構在一定程度上反映植物響應外界環(huán)境的生理特性，可作為種質資源評價、育種和抗逆性研究的重要依據[27-29]。柵欄組織是光合作用特化而來的細胞群，PPT/SPT 越大，柵欄組織更發(fā)達，有利于光合作用和提高光合效能，并增加抗旱性。另外，葉片的CTR 越大，SR 越小說明柵欄組織排列緊密，海綿組織不發(fā)達，從而減少蒸騰作用，更有效地減少水分流失[30-31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，木薯SC12 同源四倍體植株的PPT顯著高于二倍體親本，而SPT 顯著低于親本，四倍體PPT/SPT 是對照的1.9 倍，且緊密度高，進一步說明其抗旱性高。本研究以木薯品種SC12 離體單芽莖段為誘導材料，0.03 g/L 濃度的秋水仙素處理48 h 后，同源四倍體效率最高，為7.78%；經過流式細胞儀、染色體技術、細胞解剖學比較鑒定，獲得了10 個同源四倍體和6 個嵌合體植株。二倍體和同源四倍體植株表現(xiàn)出顯著的形態(tài)和生理差異，同源四倍體葉片變厚，裂葉長/裂葉寬顯著降低，葉綠素含量顯著增加；四倍體株系SC12-11 的單株薯重和收獲指數分別為3.30 kg 和0.43，顯著高于對照二倍體株系。