趙曉燕，張勇剛，沈瑞芳，劉淑嬌

1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)系，山西朔州 036002；2.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，山西朔州 036002；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)空間環(huán)境與物質(zhì)科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150001

士的寧（strychnine）又名番木鱉堿，是馬錢子中主要的藥理成分[1]，能抗腫瘤、抗炎癥、促進(jìn)血液循環(huán)，還具有抗疼痛、保護(hù)神經(jīng)等多種作用，故具有十分重要的藥用價值[2-3]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，士的寧對脊髓、延髓與大腦皮層等神經(jīng)中樞均有興奮性作用[4]，通過調(diào)節(jié)生物體Na+電流、K+電流、Ca2+電流等各種電流[5]，或者神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿[6]和甘氨酸[7]等來影響神經(jīng)元的興奮性。神經(jīng)元的興奮性又能夠影響整個神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制。已有研究證明，一些神經(jīng)系統(tǒng)類的疾病，如精神病、癲癇、老年癡呆、孤獨(dú)癥譜系障礙等疾病的發(fā)生均與神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮和過度抑制有關(guān)[8]。在保持神經(jīng)元靜息電位不變的前提下，研究士的寧對動作電位（action potential, AP）閾值的影響，可以檢測士的寧對神經(jīng)元興奮性的作用。通過研究單個AP 和單位時間內(nèi)AP 發(fā)放個數(shù)，可以進(jìn)一步探究具體是作用于何種離子而引起興奮性，探討是否對神經(jīng)元有保護(hù)作用，所以探究士的寧對神經(jīng)元興奮性的影響具有十分重要的意義。本文選取2019 年6—10 月大連理工大學(xué)提供的小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞30 個，采用膜片鉗技術(shù)，以皮層神經(jīng)元細(xì)胞為材料，探究士的寧對皮層神經(jīng)元AP 和電壓依賴性K+電流的影響，初步研究士的寧對神經(jīng)興奮性的影響和作用機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

KM 小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞由大連理工大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 全細(xì)胞膜片鉗記錄 采用5 步拉制法拉制出玻璃微電極，灌注電極內(nèi)液，電極電阻為7～9 MΩ。棄掉培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入2 mL 電極外液。通過倒置顯微鏡，找胞體呈錐體形或三角形、表面干凈、有較強(qiáng)反光的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。借助三維操縱儀把正壓的玻璃微電極靠近皮層神經(jīng)元，把正壓撤去，向下移動玻璃微電極，使其與皮層神經(jīng)元細(xì)胞膜剛剛接觸，通過給予玻璃微電極適當(dāng)負(fù)壓，使其與細(xì)胞膜緊密吸附形成高阻封接，接著通過施加快速負(fù)壓打破神經(jīng)元細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。

1.2.2 分組與處理 隨機(jī)選取6 個小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞形成全細(xì)胞膜片鉗記錄。針對每一個皮層神經(jīng)元細(xì)胞，在加藥前用膜片鉗記錄的數(shù)據(jù)為對照組，通過MPS-1 加藥系統(tǒng)分別加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L 士的寧所得數(shù)據(jù)作為A、B、C、D、E 共5 個實(shí)驗(yàn)組。發(fā)現(xiàn)1、10 μmol/L 士的寧能顯著地抑制動作電位閾值，即可以影響皮層神經(jīng)元興奮性，而0.001、0.01、0.1 μmol/L 士的寧沒有影響，所以后續(xù)不需要再進(jìn)行研究。士的寧的中毒劑量是5～10 mg[9]，本研究所選的5 個濃度均在安全范圍，1、10 μmol/L士的寧均有作用，但士的寧的安全劑量范圍比較小[10]，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅選取小劑量D組即1 μmol/L進(jìn)行研究。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 AP 閾值 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：將膜電流鉗制在200 pA，給予時程為10 ms 的閾上刺激，記錄加藥前AP 閾值。

1.3.2 AP 上升支和下降支時程 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：膜電流鉗制在160 pA，給予時程為10 ms 的閾上刺激，誘發(fā)AP，記錄加藥前后AP 上升支和下降支時程。

1.3.3 單個AP 峰值 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：膜電流鉗制在100 pA，給予時程為500 ms 的閾上刺激，記錄加藥前后單個AP 峰值。

1.3.4 AP 重復(fù)發(fā)放頻率 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：設(shè)置（500 ms，100 pA）的電流鉗制刺激，記錄加藥前后AP 發(fā)放個數(shù)。

1.3.5 電壓依賴性K+電流 采用電壓鉗技術(shù)，具體Protocol：將膜電壓鉗制在-10 mV，先給予一個時程為300 ms，復(fù)極化至-100 mV 的刺激，再恢復(fù)至-10 mV 后去極化至+40 mV，每10 mV 階躍1 次，時程150 ms。為了排除細(xì)胞間的差異，用電流密度（pA/pF）代替電流，計(jì)算公式：pA/pF=Imax/Cs（Imax是電流峰值，Cs 為膜電容）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用Pulse 和Clamfit 軟件設(shè)置記錄參數(shù)（protocal）、統(tǒng)計(jì)和整理數(shù)據(jù)，再使用Origin 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同士的寧濃度間神經(jīng)元細(xì)胞的AP 閾值比較

A、B、C 組神經(jīng)元AP 閾值低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。D、E 組神經(jīng)元AP 閾值低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同士的寧濃度間神經(jīng)元細(xì)胞的AP 閾值比較[(±s),mV]

表1 不同士的寧濃度間神經(jīng)元細(xì)胞的AP 閾值比較[(±s),mV]

注：t 值、P 值為各組與對照組比較所得檢驗(yàn)值

組別對照組（n=6）A 組（n=6）B 組（n=6）C 組（n=6）D 組（n=6）E 組（n=6）士的寧濃度（μmol/L）0 0.001 0.01 0.1 1 10 AP 閾值-41.43±1.31-41.51±1.50-41.57±1.59-42.63±1.80-44.30±1.99-46.54±2.41 t 值0.098 0.166 1.320 2.951 4.563 P 值＞0.05＞0.05 0.110 0.008＜0.001

2.2 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的AP 時程寬度比較

D 組AP 上升支時程高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D 組AP 下降支時程高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的AP 時程寬度比較[(±s),ms]

表2 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的AP 時程寬度比較[(±s),ms]

組別對照組（n=6）D 組（n=6）t 值P 值A(chǔ)P 上升支時程2.83±0.21 2.91±0.23 0.629 0.250 AP 下降支時程4.56±0.38 6.02±0.71 4.441＜0.001

2.3 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的單個AP 峰值比較

D 組單個AP 峰值低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的單個AP 峰值比較[(±s),mV]

表3 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的單個AP 峰值比較[(±s),mV]

組別對照組（n=6）D 組（n=6）t 值P 值單個AP 峰值30.23±3.76 22.12±2.13 4.597＜0.001

2.4 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的AP 個數(shù)比較

D 組AP 個數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的AP 個數(shù)比較[(±s),個]

表4 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的AP 個數(shù)比較[(±s),個]

組別對照組（n=6）D 組（n=6）t 值P 值A(chǔ)P 個數(shù)6.84±1.73 4.52±1.21 2.692 0.012

2.5 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的電流密度比較

在膜電位≥-10 mV 時，D 組電流密度呈電壓依賴性地低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的電流密度比較[(±s),PA/PF]

表5 D 組與對照組神經(jīng)元細(xì)胞的電流密度比較[(±s),PA/PF]

膜電位（mV）-10 0 10 20 30 40對照組（n=6）176.72±16.76 255.14±20.37 369.69±21.30 487.41±23.25 627.79±32.47 759.52±44.62 D 組（n=6）130.13±26.95 186.10±25.45 256.60±24.57 325.16±26.63 390.81±30.59 448.02±36.45 t 值3.596 5.188 8.519 11.242 13.012 13.243 P 值0.002＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

士的寧作為中樞興奮類藥物，當(dāng)前對其研究主要集中在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制方面。一些作用于中樞系統(tǒng)類的藥物可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程或者離子活動來傳導(dǎo)興奮性或抑制性信號[11-12]。膜片鉗電生理技術(shù)已經(jīng)成熟，故藥理機(jī)制的研究越來越多從離子通道著手，所以本文利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，以新生KM 小鼠皮層神經(jīng)元為材料，通過研究AP 和電壓依賴性K+電流，來探討士的寧對皮層神經(jīng)元的中樞興奮性機(jī)制。首先采用電流鉗技術(shù)研究士的寧對單個AP 的閾電位的作用，發(fā)現(xiàn)士的寧能降低閾電位，說明士的寧能興奮皮層神經(jīng)元。Tan T 等[13]研究表明：降低AP 閾值能提高神經(jīng)元興奮性與本研究一致，又因?yàn)锳P 上升支主要是因?yàn)殡妷阂蕾囆遭c電流引起[14]，而AP 下降支主要是由電壓依賴性K+電流引起[15]，所以又研究了士的寧對單個AP 時程寬度的影響，發(fā)現(xiàn)士的寧能主要影響AP 下降支時程，對上升支時程沒有影響，所以士的寧降低AP 閾值是因?yàn)殡妷阂蕾囆訩+外流引起。

此外，已有研究表明，一些神經(jīng)保護(hù)類藥物可以通過抑制皮層神經(jīng)元電壓依賴性K+，能夠延長單一動作電位下降支時程，減少單位時間內(nèi)動作電位重復(fù)發(fā)放頻率，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。本文研究士的寧對連續(xù)AP 的作用，發(fā)現(xiàn)其能夠降低重復(fù)發(fā)放頻率，這也表明士的寧可以興奮皮層神經(jīng)元，對神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用，并初步推測士的寧對皮層神經(jīng)元的興奮性主要是通過作用于K+電流來實(shí)現(xiàn)的。故本研究又檢測了士的寧對電壓依賴性K+電流的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膜電位≥-10 mV 時，士的寧能顯著地降低電流密度且呈電壓依賴性，這就證明了上述推測是正確的。類似研究中，以豚鼠心肌細(xì)胞為材料，同樣采用膜片鉗技術(shù)研究馬錢子對電壓依賴性K+電流的作用，結(jié)果顯示3 μmol/L 馬錢子使+40 mV 時電流密度由（1.12±0.21）降為（0.95±0.24）（n=6，P＜0.05）[17]，因?yàn)轳R錢子的主要藥理成分是士的寧[1]，同樣證明士的寧對電壓依賴性K+電流有抑制作用，與本研究結(jié)果基本一致。本研究在40 mV 時電流密度由（759.52±44.62）PA/PF 降為（448.02±36.45）PA/PF（P＜0.05），可能是因?yàn)槟てQ儀器不同、細(xì)胞存在差異和具體的刺激Protocol 不一樣引起，但是針對每一個細(xì)胞，均是通過加藥前后進(jìn)行對比，影響趨勢是一致的。

Zlotos DP 等[18]從神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程著手來研究士的寧的中樞興奮作用，其研究顯示小劑量的士的寧能夠與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)-甘氨酸競爭受體結(jié)合，解除抑制，興奮中樞神經(jīng)如大腦皮層感覺中樞，降低感覺神經(jīng)末梢和交感神經(jīng)的興奮閾值，能使昏迷的患者蘇醒過來，與本研究結(jié)果一致。但是已有研究證明士的寧能夠透過血腦屏障[19]，所以本研究著重以皮層神經(jīng)元細(xì)胞為直接作用對象，通過膜片鉗技術(shù)研究AP，從離子通道的角度解釋了小劑量士的寧能夠興奮大腦皮層，使昏迷的患者蘇醒[12]。

綜上所述，小劑量士的寧一方面能夠興奮大腦皮層，其作用機(jī)制是降低AP 閾值，提高皮層神經(jīng)元興奮性；另一方面小劑量士的寧能夠通過抑制皮層神經(jīng)元電壓依賴性K+電流，減少復(fù)極化中K+外流，降低AP 重復(fù)發(fā)放頻率，減少能量消耗，保護(hù)皮層神經(jīng)細(xì)胞。