于心薈 李元文 任雪雯 鄧宇童 王瑩 王化龍 劉曉東 馮蕙裳

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性復(fù)發(fā)性皮膚疾病,臨床表現(xiàn)主要是鱗屑性紅斑或斑塊,世界范圍內(nèi)發(fā)病率約1%～3%[1]。免疫異常被視為銀屑病發(fā)病的重要環(huán)節(jié),免疫細(xì)胞激活后產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子,促進(jìn)細(xì)胞增殖角化及炎癥細(xì)胞浸潤,導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生發(fā)展。化斑解毒方是李元文教授通過前期數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)與理論探索總結(jié)出的中藥方劑[2],臨床應(yīng)用于尋常型銀屑病血熱證患者具有確切療效,能夠有效減輕患者皮膚炎癥反應(yīng),但其治療銀屑病的作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過測定不同濃度的化斑解毒方對咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-23(interleukin-23,IL-23)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表達(dá)水平的影響,探究其治療銀屑病的抗炎作用,并為化斑解毒方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性BALB/c小鼠60只,8周齡,體質(zhì)量約20 g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物質(zhì)量合格證號:110324221101061643;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCKX(京)2019-0010。小鼠于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

化斑解毒方組成:白花蛇舌草30 g、半枝蓮15 g、威靈仙10 g、蒼術(shù)10 g、土茯苓15 g、生槐花10 g、玄參20 g、生地10 g、香附10 g、牛蒡子10 g、知母10 g、金銀花15 g、豬苓10 g、白術(shù)10 g、炙甘草6 g。所用藥物為顆粒劑,由江陰天江藥業(yè)有限公司配制,產(chǎn)品批號2202306。

甲氨蝶呤片(通化茂祥制藥有限公司,產(chǎn)品批號:197220504,規(guī)格:2.5 mg);咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司,產(chǎn)品批號40220501,規(guī)格:250 mg∶12.5 mg)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

凡士林(德新康,批號:Q/371426DXK027);4%多聚甲醛(Solarbio,批號:P1110);蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(北京中科萬邦生物科技有限公司,批號:RY-0002);中性樹膠封片劑(北京中科萬邦生物科技有限公司,批號:FP-0001);TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司,批號分別為:MD7125、MD16214、MD124889、MD53662);NF-κBp65抗體(Abcam,批號:AB32536);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Affinity,批號:T0021)。

數(shù)碼相機(jī)(Leica);JT-12S脫水機(jī)、JB-P7包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);電泳儀(美國Bio-Rad);Spectramac M3多功能酶標(biāo)儀(美國MD);紫外分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾科技公司);ST16R高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Sorvall);THZ-312 臺(tái)式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國ChemiDoc MP)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組與造模 將60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,全部予背部去毛,面積約2 cm×3 cm。以隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、化斑解毒方低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組,每組10只。脫毛后24小時(shí)確認(rèn)小鼠脫毛處無損傷后開始造模,空白組小鼠于備皮區(qū)每日涂抹凡士林62.5 mg,其余各組涂抹等質(zhì)量5%咪喹莫特乳膏,連續(xù)7天。

1.4.2 給藥方法 造模后,各組均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)并自由飲水,每3天更換墊料。造模開始第二日予以干預(yù),每組小鼠以0.1 mL/(10 g·d)灌胃1次,空白組與模型組小鼠予以蒸餾水,化斑解毒方低、中、高劑量組分別予中藥1/2倍、1倍及2倍量,甲氨蝶呤組予甲氨蝶呤片混懸液。小鼠灌胃藥物劑量根據(jù)體表法進(jìn)行計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)成年人體質(zhì)量70 kg,則對應(yīng)小鼠藥物劑量約為成人的9.1倍,折算出化斑解毒方中劑量組小鼠每日給藥劑量為24.83 g/kg,甲氨蝶呤組每日給藥劑量為1 mg/kg。

1.4.3 取材方法 在實(shí)驗(yàn)第7天進(jìn)行標(biāo)本制備,對小鼠予4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉。取小鼠背部銀屑病皮損集中皮膚(全層創(chuàng)面),面積為2 cm×2 cm的正方形,空白組取相同部位,所得皮膚組織以90°為范圍平均分為4份,3份置于無菌無酶凍存管,置于液氮冷凍后,放于-80℃超低溫冰箱保存用于做蛋白檢測;1份放于4%多聚甲醛中固定,用于切片染色。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 各組小鼠皮損變化情況評價(jià) 于模型建立及治療期間,每日觀察各組小鼠皮損變化,并采用數(shù)碼相機(jī)對同一部位拍照記錄。觀察期間無小鼠死亡情況,重復(fù)數(shù)量為1。根據(jù)校正后的銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index,PASI)評分作為標(biāo)準(zhǔn),對鱗屑、浸潤、紅斑的嚴(yán)重程度進(jìn)行評分,由輕到重分為5個(gè)等級,從0到4進(jìn)行賦分。計(jì)算三項(xiàng)評分之和表示皮損嚴(yán)重程度;取每日各組總分平均值繪制趨勢線,從而反映小鼠皮損的變化情況。

1.5.2 皮膚組織HE染色及觀察 取固定于4%多聚甲醛中的皮膚組織,修剪至合適大小,二甲苯脫蠟后,用從高到低濃度酒精及蒸餾水洗脫,蘇木素水溶液染色10分鐘,0.7%鹽酸乙醇分化30秒,置于酒精中脫水,酒精伊紅染色2分鐘,沖洗后先后酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片,放置于顯微鏡下觀察并攝片。

1.5.3 皮膚組織炎癥因子水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組小鼠皮膚組織勻漿中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23水平。將試劑盒取出平衡至室溫,取出冰箱中凍存的皮膚樣本研碎。實(shí)驗(yàn)操作步驟以ELISA檢測試劑盒為準(zhǔn)。顯色后立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度值(OD值),繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中相應(yīng)檢測目標(biāo)的濃度。

以蛋白免疫印跡法檢測皮膚標(biāo)本中NF-κB水平。取出凍存標(biāo)本加入裂解液,超聲破碎細(xì)胞取上清,按照BCA試劑盒說明書對蛋白定量,對蛋白樣品進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中封閉1小時(shí),加入用封閉液稀釋的一抗工作液4℃孵育過夜,洗凈后加入二抗工作液室溫孵育60分鐘,洗膜后使用顯色劑顯影,利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像并通過測定主帶的光密度值計(jì)算上述蛋白在皮膚組織中的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 皮損變化及評分比較

空白組小鼠未見皮損,模型組小鼠皮膚存在不同程度紅斑、浸潤、鱗屑等皮膚損害。與模型組相比,化斑解毒方各劑量組及甲氨蝶呤組小鼠皮膚紅斑色澤、浸潤程度、出現(xiàn)鱗屑皮膚面積大小、鱗屑厚度均較輕。第7天時(shí),化斑解毒方低、中、高劑量組、甲氨蝶呤組小鼠皮損相比于模型組,紅斑面積較小、顏色淺,皮膚浸潤程度較輕,鱗屑較少。見圖1。

注A 空白組;B 模型組;C 化斑解毒方低劑量組;D 化斑解毒方中劑量組;E 化斑解毒方高劑量組;F 甲氨蝶呤組。圖1 各組銀屑病樣皮炎小鼠皮膚表現(xiàn)

皮損評分結(jié)果顯示,空白組與模型組之間PASI評分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,化斑解毒方各劑量組及甲氨蝶呤組PASI評分降低,皮損癥狀改善(P<0.05)。依據(jù)PASI評分繪制化斑解毒方各劑量組與模型組、甲氨蝶呤組的7日曲線可觀察評分變化。見圖2,表1。

表1 各組銀屑病樣皮炎小鼠PASI評分比較

圖2 各組銀屑病樣皮炎小鼠PASI評分變化曲線

2.2 皮膚組織學(xué)變化

HE染色顯示:空白組角質(zhì)層細(xì)胞未見明顯異常,基底層細(xì)胞連續(xù),血管周圍及真皮淺層未見炎癥細(xì)胞浸潤;模型組表現(xiàn)為表皮角化過度伴角化不全,棘細(xì)胞數(shù)量增加,棘層肥厚,表皮突向下延伸呈棒槌狀,真皮內(nèi)可見毛細(xì)血管擴(kuò)張,血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤,類似銀屑病的皮損病理表現(xiàn);與模型組相比,化斑解毒方各劑量組和甲氨蝶呤組小鼠病理損害程度較低,表皮角化不全減輕,棘層厚度變薄,淋巴細(xì)胞浸潤減少。見圖3。

注A 空白組;B 模型組;C 化斑解毒方低劑量組;D 化斑解毒方中劑量組;E 化斑解毒方高劑量組;F 甲氨蝶呤組。圖3 各組銀屑病樣皮炎小鼠皮膚病理變化比較(HE染色,×400)

2.3 皮膚組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23表達(dá)情況

與空白組相比,模型組小鼠皮膚組織中TNF-α、IFN-γ、IL-23、IL-1β表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,各用藥組炎癥因子水平均有不同程度降低,其中以甲氨蝶呤組及化斑解毒方高劑量組最為顯著;另外,化斑解毒方低劑量組與模型組IL-23表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組銀屑病樣皮炎小鼠皮膚組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23表達(dá)水比較

2.4 皮膚組織中NF-кB表達(dá)水平

與空白組相比,模型組NF-кB表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,各用藥組NF-кB表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);化斑解毒方各劑量組NF-кB表達(dá)水平較甲氨蝶呤組無顯著差異(P>0.05)。因空白組中兩個(gè)數(shù)據(jù)離散度過大,考慮誤差,在統(tǒng)計(jì)過程中主動(dòng)剔除。結(jié)果見表3及圖4。

表3 各組銀屑病樣皮炎小鼠皮膚組織中NF-кB表達(dá)水平比較

注A 空白組;B 模型組;C 化斑解毒方低劑量組D 化斑解毒方中劑量組;E 化斑解毒方高劑量組;F 甲氨蝶呤組。圖4 各組銀屑病樣皮炎小鼠皮膚組織中NF-кB蛋白表達(dá)情況

3 討論

銀屑病是皮膚科常見且重大的疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確[3]。目前普遍認(rèn)為銀屑病的發(fā)病主要由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、多種細(xì)胞因子失衡及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等導(dǎo)致[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對輕度銀屑病治療以外用藥為主,中、重度常聯(lián)合甲氨蝶呤、阿維A酸、環(huán)孢素等系統(tǒng)治療,近年來生物制劑也日益廣泛應(yīng)用于銀屑病的治療[5]。中藥治療相對安全且價(jià)格適中,探索更為穩(wěn)定有效的中藥方劑有助于解除銀屑病患者的困擾,并為銀屑病的臨床治療提供更多選擇。

中醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為,銀屑病發(fā)生與“血”與“風(fēng)”兩個(gè)因素密切相關(guān),病機(jī)多為營血虧虛或外邪入里以致血熱內(nèi)蘊(yùn),生風(fēng)化燥,肌膚失養(yǎng),發(fā)為白疕[6]。李元文教授認(rèn)為尋常型銀屑病的病因病機(jī)在血熱瘀阻、化燥生風(fēng)的基礎(chǔ)之上,兼有濕邪為患,且多與毒邪相關(guān)[7]?；呓舛痉皆谀壳俺Ｓ们鍩釠鲅舛舅幦缟?、玄參、知母、金銀花、生槐花、白花蛇舌草、半枝蓮、土茯苓之外[8],加用健脾化濕之蒼術(shù)、白術(shù)、豬苓,佐以威靈仙通絡(luò),香附理氣,旨在宣通中焦之氣,氣行則血行,氣機(jī)通暢則瘀血得通、風(fēng)邪自滅,故紅斑鱗屑得以消減?；呓舛痉脚R床治療尋常型銀屑病療效確切,但其治療的分子層面的機(jī)制仍不明確,故本實(shí)驗(yàn)通過對不同濃度化斑解毒方的抗炎方面機(jī)制進(jìn)行探究。

作為由免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病,銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程由多種免疫細(xì)胞和炎癥因子共同作用。TNF-α是重要的促炎因子,可影響角質(zhì)細(xì)胞的再生、誘導(dǎo)表皮中性粒細(xì)胞浸潤,并可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同的趨化因子的細(xì)胞因子,加重炎癥反應(yīng)。IFN-γ能夠增強(qiáng)抗原加工和呈遞、誘導(dǎo)免疫反應(yīng),在銀屑病患者血清中顯著升高,并且可能與銀屑病的活動(dòng)有關(guān)[9]。IL-1β是在早起皮膚損傷中占主導(dǎo)地位的細(xì)胞因子,其增多導(dǎo)致早期銀屑病炎癥加重[10]。IL-23是銀屑病免疫反應(yīng)機(jī)制的上游炎癥因子之一,可誘導(dǎo)Thl7細(xì)胞分化產(chǎn)生細(xì)胞因子,進(jìn)一步促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及炎癥級聯(lián)反應(yīng)[11]。本研究中,甲氨蝶呤組、化斑解毒方各劑量組TNF-α、IFN-γ、IL-1β表達(dá)水平較模型組顯著降低,提示經(jīng)治療后細(xì)胞炎癥因子水平下降,組織炎癥緩解,同理甲氨蝶呤組與化斑解毒方中、高劑量組的IL-23表達(dá)水平降低亦提示炎癥減輕?；呓舛痉礁邉┝拷M與甲氨蝶呤組TNF-α、IL-23表達(dá)水平無顯著差異,提示二者在影響TNF-α、IL-23的作用上效果趨于相同。化斑解毒方低劑量組IL-23表達(dá)水平與模型組無顯著差異,提示對此炎癥因子作用效果不明顯,考慮血藥濃度可能未達(dá)到起效水平,或與造模用藥時(shí)間較短等因素有關(guān),具體原因需進(jìn)一步探究。

NF-кB被認(rèn)為是免疫及炎癥反應(yīng)的中心樞紐,激活后可誘導(dǎo)下游炎癥因子和趨化因子表達(dá),促進(jìn)組織炎癥發(fā)生[12]。NF-кB在銀屑病過程中表達(dá)水平升高[13],并可調(diào)控細(xì)胞凋亡,影響銀屑病炎癥進(jìn)展[14]。本研究結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組NF-кB表達(dá)水平顯著升高,提示在咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎小鼠中NF-кB過度激活;與模型組相比,各用藥組NF-кB顯著下調(diào),提示化斑解毒方的抗炎作用可能與抑制NF-кB表達(dá)有關(guān),且下調(diào)情況在化斑解毒方各組間呈現(xiàn)一定的量效差異?；呓舛痉礁鲃┝拷MNF-кB表達(dá)水平與甲氨蝶呤組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示化斑解毒方可有效抑制銀屑病皮損中的NF-кB表達(dá),從而改善炎癥反應(yīng)。

綜上所述,化斑解毒方在改善銀屑病皮損癥狀及組織病理學(xué)表現(xiàn)上有確切治療作用;同時(shí)在分子層面上,化斑解毒方能夠通過降低TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-23的表達(dá)水平、抑制NF-кB在組織細(xì)胞中的表達(dá)減輕炎癥反應(yīng),起到抗炎作用,且化斑解毒方的抑制炎癥作用與使用劑量呈正相關(guān)。但是,本研究所檢測的只是銀屑病炎癥反應(yīng)相關(guān)的部分細(xì)胞因子,沒有涉及細(xì)胞通路及其他治療機(jī)制方面的研究;且咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠模型不能完全代表人類銀屑病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程。因此,探究化斑解毒方的作用機(jī)制仍需經(jīng)過其他分子水平研究及臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。