廖艷 熱依拉·吐爾遜 高鑫 樂娜 劉冰清 楊彩玲 張建軍 田世民 王淳

《中國失眠障礙診斷和治療指南》顯示[1],失眠是睡眠障礙的一種,其特征為頻繁而持續(xù)的入睡困難或睡眠維持困難并導(dǎo)致睡眠滿意度不足,長期睡眠障礙易出現(xiàn)疲勞、精神萎靡、情緒不穩(wěn)等癥狀。在我國,失眠的發(fā)病率高達(dá)30%[2],目前對其根治仍無較好措施。中醫(yī)在調(diào)理失眠特別是早期失眠即亞健康失眠方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[3]。辨證思想是中醫(yī)藥的精髓,中醫(yī)認(rèn)為,思慮傷脾、暗耗心血,心神失養(yǎng)誘發(fā)的心神不安是失眠的常見類型,治則多以養(yǎng)血安神,補(bǔ)益心脾為主[4]。因此,本研究擬選擇失眠常見的中醫(yī)證候心脾兩虛證[5],復(fù)制心脾兩虛亞健康失眠小鼠模型,在臨床經(jīng)驗(yàn)方“補(bǔ)脾養(yǎng)心方”(酸棗仁、茯苓、靈芝、刺五加、五味子)的基礎(chǔ)上[6],探討該方對于心脾兩虛亞健康失眠小鼠的補(bǔ)益心脾功效和睡眠改善作用,為后續(xù)辨證保健應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康雄性昆明小鼠60只,體質(zhì)量18～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0010。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房,給予小鼠普通飼料,自由飲水,室溫(22±2)℃,相對濕度為60%～70%,燈照周期為12小時。實(shí)驗(yàn)通過北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查,符合相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

酸棗仁(批號:19062705)、靈芝(批號:20170101)、刺五加(批號:180605002)、茯苓(批號:20071901)、五味子(批號:18101102)、人參歸脾丸(批號:20035001)均購自北京同仁堂;戊巴比妥鈉(上海伊卡生物技術(shù)有限公司,批號:20170611)、巴比妥鈉(北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司,批號:570471)、鹽酸普萘洛爾片(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司,批號:1703098)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

定制玻璃游泳箱(規(guī)格:75 cm×55 cm×40 cm)、離心機(jī)(德國Eppendorf)、全自動生化儀(UZS-300X)、電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)、電子秤(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)、制冰機(jī)(松下冷鏈大連有限公司)、冷凍切片機(jī)(CryoStar NX50)、超分辨顯微組織成像系統(tǒng)(Leica)。

1.4 補(bǔ)脾養(yǎng)心方的制備

補(bǔ)脾養(yǎng)心方用藥組成為酸棗仁、靈芝、刺五加、茯苓、五味子,因該方目前在專利申請階段,故本文暫略去其劑量及比例,但根據(jù)文獻(xiàn)[6]換算后小鼠灌胃低、中、高劑量的濃度分別是:0.15 g/mL,0.3 g/mL,0.6 g/mL。取5倍處方量藥材,加水(10倍藥材量)(V1),浸泡12小時過夜。濾出浸泡液,測定體積(V2),計算吸水倍數(shù)。再加水至藥材完全浸沒,測定體積(V3),計算加水倍數(shù)。

加水10倍量,浸泡1小時,煎煮3次,每次45分鐘,合并濾液,沸騰濃縮至120 mL,使藥液含藥量達(dá)到0.6 g/mL。將120 mL濃縮藥液分成3份,分別為65 mL、35 mL、20 mL。取35 mL藥液加水35 mL,使藥液含藥量變?yōu)?.3 g/mL,得到70 mL含藥量0.3 g/mL的藥液,即中劑量組藥液。取20 mL藥液加水60 mL,使含藥量變?yōu)?.15 g/mL,得到80 mL含藥量0.15 g/mL的藥液,即低劑量組藥液。每周煮藥1次,共4次。

1.5 人參歸脾丸藥液的配制

陽性對照藥為人參歸脾丸,每丸重9 g,根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[4],小鼠給藥濃度為0.5 g/mL。

1.6 分組與給藥方法

將60只雄性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7日后,隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組(5 g/kg)、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低(1.5 g/kg)、中(3 g/kg)、高劑量組(6 g/kg),每組10只。每日上午給予空白對照組小鼠生理鹽水,其余各組給予相應(yīng)劑量的藥物,灌胃劑量0.1 mL/10 g,根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整灌胃量,連續(xù)給藥30天。灌胃第27～30天,空白對照組每日下午給予生理鹽水,其余各組給予鹽酸普萘洛爾溶液1.5 mg/100 g,灌胃劑量0.1 mL/10 g,每日1次,連續(xù)4日。

1.7 體質(zhì)量與攝食量測定

于實(shí)驗(yàn)開始第1天、第14天、第21天、第28天記錄各組小鼠體質(zhì)量,觀察給藥后各組小鼠體質(zhì)量變化;于實(shí)驗(yàn)第1天、第14天、第28天稱量各組小鼠24小時內(nèi)攝食量。

1.8 胸腺、脾臟指數(shù)測定

實(shí)驗(yàn)第30天,各組小鼠眼球取血后,立即剖腹稱取胸腺和脾臟,計算胸腺、脾臟指數(shù)。

1.9 睡眠時間和睡眠潛伏期的測定

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)判定末次給藥后各組小鼠腹腔注射55 mg/kg戊巴比妥鈉、30 mg/kg戊巴比妥鈉(最大閾下催眠劑量)、300 mg/kg巴比妥鈉,注射量均為0.1 mL/10 g,測定小鼠翻正反射,超過60秒仍無法翻正,則為進(jìn)入睡眠并記錄各組小鼠入睡動物數(shù),以此觀察小鼠對直接睡眠實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏實(shí)驗(yàn)的影響。

1.10 力竭負(fù)重游泳時間和懸尾不動時間測定

力竭負(fù)重游泳從灌胃開始的第16日起,灌胃給藥結(jié)束1小時后,除空白對照組外,其余各組進(jìn)行負(fù)重力竭游泳運(yùn)動,首先計算各組小鼠體質(zhì)量的5%作為負(fù)荷重量,并制作相應(yīng)劑量的鉛塊,實(shí)驗(yàn)開始前,將對應(yīng)的鉛塊固定在小鼠尾部,隨即將小鼠放入定制的游泳箱內(nèi),水溫(20±5)℃,水深25 cm,確保小鼠掉入水中時尾巴不能接觸到游泳箱底部。每箱放入2只,從小鼠進(jìn)入游泳箱內(nèi)開始計時。

力竭游泳的判斷標(biāo)準(zhǔn):小鼠運(yùn)動失調(diào),頭部無法浮出水面,并且沉入水底超過5～8秒無法上浮。此時立刻將小鼠撈出水面,記錄力竭游泳時間;同時將小鼠放入平坦桌面,開始記錄小鼠懸尾不動時間。

1.11血清指標(biāo)測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組小鼠過夜禁食16小時,稱重并處死。迅速眼球取血,血液樣本靜置2小時后,離心取上清進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(creatine kinase,CK)含量檢測。

1.12小鼠心肝脾和肌肉組織病理學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組小鼠過夜禁食16小時,稱重并處死。迅速采集肝臟、心臟組織、脾臟、肌肉組織樣本。取相同部位心、肝、脾、肌肉組織,甲醇固定24小時脫水,石蠟包埋,切片后蘇木素—伊紅(HE)染色,400倍光鏡下觀察心、肝、脾、肌肉組織形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 對體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)第14天、21天和28天,與空白對照組比較,模型組體質(zhì)量明顯下降;與模型組相比,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組體質(zhì)量明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 對攝食量的影響

實(shí)驗(yàn)第14天,與模型組相比,陽性對照組小鼠攝食量增加;實(shí)驗(yàn)第28天,與空白對照組比較,模型組小鼠攝食量明顯減少;與模型組相比,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組攝食量明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠攝食量的影響

2.3 對力竭游泳時間和懸尾不動時間的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠力竭游泳時間明顯縮短,懸尾不動時間明顯延長;與模型組相比,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組小鼠力竭游泳時間明顯延長,懸尾不動時間明顯縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表3。

表3 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠力竭游泳和懸尾不動時間的影響

2.4 對胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有明顯下降;與模型組比較,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有提高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

2.5 對睡眠的影響

在直接睡眠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,各組小鼠均無產(chǎn)生直接睡眠(P>0.05)。與空白對照組相比,模型組睡眠時間明顯縮短,并延長了睡眠潛伏期;與模型組相比,陽性對照組和補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組均延長了睡眠時間,縮短了睡眠潛伏期,發(fā)生了閾下劑量的睡眠行為,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠睡眠的影響

2.6 對血清ALT、AST、ALP的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠ALT、AST、ALP含量明顯升高;與模型組比較,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組的ALT、AST、ALP含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表6。

表6 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠血清ALT、AST、ALP的影響

2.7 對血清CK、LDH的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠CK和LDH含量明顯升高;與模型組比較,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組小鼠CK和LDH均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表7。

表7 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠血清CK、LDH的影響

2.8 對小鼠心、肝、脾、肌肉組織的影響

2.8.1 對小鼠心臟組織的影響 與空白對照組相比,模型組細(xì)胞間隙增大,部分線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整;陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組細(xì)胞間隙正常,心肌纖維排列整齊,陽性對照組和補(bǔ)脾養(yǎng)心方高劑量組改善更明顯。詳見圖1。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補(bǔ)脾養(yǎng)心方低劑量組;E 補(bǔ)脾養(yǎng)心方中劑量組;F 補(bǔ)脾養(yǎng)心方高劑量組。圖1 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠心臟組織的影響(HE,×400)

2.8.2 對小鼠肝臟組織的影響 與空白對照組比較,模型組肝細(xì)胞密集、體積縮小,核密度增大,細(xì)胞間隙大,雙核細(xì)胞增多,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡。與模型組相比,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常,細(xì)胞圓潤,細(xì)胞間隙明顯縮小,空泡和雙核細(xì)胞出現(xiàn)較少,陽性對照組和補(bǔ)脾養(yǎng)心方高劑量組改善更明顯。詳見圖2。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補(bǔ)脾養(yǎng)心方低劑量組;E 補(bǔ)脾養(yǎng)心方中劑量組;F 補(bǔ)脾養(yǎng)心方高劑量組。圖2 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠肝臟組織的影響(HE,×400)

2.8.3 對小鼠脾臟組織的影響 與空白對照組相比,模型組紅白髓分界不清晰,結(jié)構(gòu)不完整,出現(xiàn)紊亂,呈現(xiàn)出散在的小團(tuán)狀;與模型組比較,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組脾臟紅白髓界限逐漸清晰,結(jié)構(gòu)完整,呈現(xiàn)出完整的形狀,淋巴細(xì)胞密度增大。詳見圖3。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補(bǔ)脾養(yǎng)心方低劑量組;E 補(bǔ)脾養(yǎng)心方中劑量組;F 補(bǔ)脾養(yǎng)心方高劑量組。圖3 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠脾臟組織的影響(HE,×400)

2.8.4 對小鼠肌肉組織的影響 與空白對照組相比,模型組小鼠肌肉組織染色改變,肌纖維間隙增大,出現(xiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤;與模型組相比,陽性對照組、補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高劑量組小鼠肌纖維間隙明顯縮小,炎性細(xì)胞較少,肌纖維排列趨于整齊。詳見圖4。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補(bǔ)脾養(yǎng)心方低劑量組;E 補(bǔ)脾養(yǎng)心方中劑量組;F 補(bǔ)脾養(yǎng)心方高劑量組。圖4 補(bǔ)脾養(yǎng)心方對各組小鼠肌肉組織的影響(HE,×400)

3 討論

失眠證又稱“不寐”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,不寐的總體病機(jī)可概括為陰陽失交,臟腑氣血功能失調(diào)[7-9]。心脾兩虛,本在脾虛,脾胃為氣血生化之源,心主血脈、主神志,若氣血生化乏源,則無以濡養(yǎng)心神,心神失養(yǎng)而進(jìn)一步導(dǎo)致失眠[10]?，F(xiàn)代臨床研究中,心脾兩虛證常表現(xiàn)為乏力、疲勞、心悸等,故治則多以補(bǔ)益心脾、寧心安神為主[11]。基于對1081例診斷為失眠患者的診療信息進(jìn)行整合,發(fā)現(xiàn)失眠患者多以虛證為主,尤以心脾兩虛證居多[5]。故本研究結(jié)合中醫(yī)辨證論治及辨證保健的思想[12],并在前期組方“補(bǔ)脾養(yǎng)心方”的基礎(chǔ)上[6],探討該方對心脾兩虛亞健康失眠小鼠補(bǔ)益心脾和改善睡眠的作用。

補(bǔ)脾養(yǎng)心方由酸棗仁、靈芝、茯苓、刺五加、五味子組成。其中酸棗仁和靈芝酸甘化陰,滋肝血以調(diào)暢情志,補(bǔ)心氣以安神助眠;茯苓利水滲濕以健脾寧心;刺五加補(bǔ)益心脾,益氣養(yǎng)血;五味子酸溫,斂心氣,助酸棗仁、靈芝、茯苓健脾寧心。據(jù)《中成藥辭典》[13]和《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第四冊[14]記載,人參歸脾丸處方來源于《濟(jì)生方》中歸脾湯,適用于思慮過度、心脾兩虛所致的心悸怔忡、失眠健忘等,故選擇具有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心功效的人參歸脾丸作為陽性對照藥進(jìn)行本次研究。

目前的失眠模型多使用氯苯丙氨酸誘導(dǎo)[15],其優(yōu)勢在于操作方便、耗時短且成功率較高,但該誘導(dǎo)更偏向于評價疾病狀態(tài)。李貴海[16]使用多平臺水環(huán)境法建立睡眠剝奪大鼠模型,探究養(yǎng)心安神法對其改善睡眠作用;徐立等[17]用每日負(fù)重游泳+實(shí)驗(yàn)后四天灌服心得安溶液、皮下注射利血平建立心脾兩虛失眠模型。本實(shí)驗(yàn)在上述模型研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合亞健康失眠人群特點(diǎn),基于已有文獻(xiàn)[18],使用行為學(xué)與灌服心得安藥物的方式復(fù)制心脾兩虛亞健康失眠小鼠模型開展研究。

心脾兩虛證候評價要素中,小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量和攝食量是其評價體系中常用的生理狀態(tài)指標(biāo)。灌胃一周至兩周后,模型組小鼠體質(zhì)量開始下降,攝食量減少,提示模型組小鼠表現(xiàn)出心脾兩虛證候的指征。力竭游泳時間和懸尾不動時間這兩項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)也是評價心脾兩虛的有力指標(biāo)[19]?！端貑枴ゐ粽撈吩?“脾主身之肌肉[20]?！奔雌饨∵\(yùn),則肌肉豐盈而有活力,反之則肌肉痿縮不用。漢代張仲景提出:“虛勞虛煩不得眠。”本研究中模型組小鼠力竭游泳時間明顯縮短且其懸尾不動時間延長,符合脾虛證候的判別要素。此外,模型組小鼠心臟組織出現(xiàn)少量炎癥改變,肝臟組織細(xì)胞體積縮小,脾臟組織分界模糊,肌肉組織肌纖維斷裂等病理學(xué)改變。綜上,通過基本生理指標(biāo)、行為學(xué)和病理學(xué)分析,表明本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的模型小鼠具備了心脾兩虛證候特征。

研究表明,LDH和CK是與睡眠相關(guān)的生物標(biāo)記物[21]。CK、LDH常用作心肌能量代謝以及骨骼肌損傷和修復(fù)的重要標(biāo)志。本研究中模型組小鼠CK和LDH升高,提示CK和LDH可能在改善睡眠和心脾兩虛證候中起著重要的調(diào)節(jié)作用。胸腺和脾臟是重要的免疫器官,可以直接反映機(jī)體的免疫力[22],正常的睡眠—覺醒周期又高度依賴于機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能[23]。模型組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)降低,提示其免疫功能下降,也反映其睡眠狀態(tài)不佳和心脾兩虛的證候。

本研究探討了補(bǔ)脾養(yǎng)心方對心脾兩虛失眠小鼠的補(bǔ)益心脾作用,相比模型組,補(bǔ)脾養(yǎng)心方低、中、高三個劑量組和陽性對照組小鼠力竭游泳時間明顯延長,懸尾不動時間縮短;心、肝、脾、肌肉組織病理變化均有所好轉(zhuǎn),表明心脾兩虛癥狀明顯改善,且補(bǔ)脾養(yǎng)心方可以延長睡眠時間、縮短睡眠潛伏期,降低戊巴比妥鈉閾下劑量,提示對小鼠睡眠情況也有所改善。此外,補(bǔ)脾養(yǎng)心方三個劑量組均能下調(diào)血清中ALT、AST、ALP含量,使其趨于正常水平,提示可能有一定的保肝作用且安全性較好。另外,相較于人參歸脾丸,補(bǔ)脾養(yǎng)心方藥味精簡,無明顯禁忌人群,且安全性和適用性良好。

綜上,補(bǔ)脾養(yǎng)心方對心脾兩虛亞健康失眠小鼠具有良好的補(bǔ)益心脾功效和改善睡眠作用,為其后續(xù)的辨證保健研究及中醫(yī)對亞健康健康管理模式[24]提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但該方改善睡眠的可能作用機(jī)制還有待深入研究。