潘麗娟，許靜，王秀貞，姜驍，陳娜，王通，殷祥貞，楊偉強(qiáng)，遲曉元

(山東省花生研究所，山東青島 266100)

在油料作物中，油脂主要以三酰甘油(triacylgycerol，TAG)的形式貯存在種子中。 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)是催化二酰甘油合成TAG 的關(guān)鍵限速酶[1，2]。 目前報(bào)道的DGAT 存在四種類型——DGAT1、DGAT2、DGAT3 和DGAT/WS，彼此之間基因序列同源性很低，具有不同的亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式[3－5]，但都具有催化在二酰甘油加上?；舅嵘筛视腿サ淖饔肹6－8]。

過(guò)表達(dá)DGAT1基因可促進(jìn)種子中油脂的積累。 擬南芥DGAT1在煙草中過(guò)表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因煙草種子中TAG 含量顯著上升[9]。 擬南芥突變體AS11的種子中DGAT1 活性降低，TAG 含量降低，脂肪酸組成發(fā)生變化，種子皺縮，發(fā)育遲緩，平均重量降低[10]；而在野生型擬南芥中過(guò)量表達(dá)AtDGAT1后，種子含油量和千粒重得到明顯提高[11]。 過(guò)量表達(dá)高油玉米DGAT1的轉(zhuǎn)基因玉米種子含油量和油酸含量分別提高26.1% 和84.5%[12]。DGAT2在油料作物中過(guò)量表達(dá)，也能調(diào)控種子油脂的含量和組成[13，14]，如蓖麻DGAT2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)蓖麻油中蓖麻油酸含量的增加[15]。DGAT3 和DGAT/WS 發(fā)現(xiàn)較晚，目前研究?jī)H限于少數(shù)植物或微生物中，DGAT3 在TAG 合成中的功能已經(jīng)在花生和產(chǎn)油酵母(oleaginous yeast)中被驗(yàn)證[16]。

在花生中，Saha 等(2006)從未成熟種子的子葉中首先克隆到AhDGAT3基因[8]； 王龍龍(2010)從花生中克隆獲得了AhDGAT2的全長(zhǎng)序列，在葉和花中表達(dá)量都較高[17]；Chi 等(2014)通過(guò)構(gòu)建的花生種子全長(zhǎng)cDNA 文庫(kù)，首次克隆獲得AhDGAT1基因[18]。 目前花生中發(fā)現(xiàn)的這三種酶，AhDGAT1 和AhDGAT2 均有跨膜結(jié)構(gòu)，屬于膜蛋白，而AhDGAT3 為可溶性蛋白；基因序列同源性很低；AhDGAT1和AhDGAT2在種子發(fā)育前中期表達(dá)量較高，而AhDGAT3則主要在種子發(fā)育后期表達(dá)[18]。 說(shuō)明它們?cè)诜N子生長(zhǎng)發(fā)育、儲(chǔ)藏物質(zhì)積累等方面所起的作用并不相同，可能在特定組織或發(fā)育階段由主效酶發(fā)揮作用[7，17]。

花生是我國(guó)重要的油料作物，近年來(lái)我國(guó)花生總產(chǎn)中約52%用于榨油，年產(chǎn)花生油近300 萬(wàn)噸，占國(guó)產(chǎn)植物油產(chǎn)量的25%以上，是國(guó)產(chǎn)植物油的第二大來(lái)源[19]。 目前提高花生品種的含油量及改善其脂肪酸組成已成為育種專家努力的方向。 隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)花生油脂合成代謝途徑及關(guān)鍵酶基因的認(rèn)識(shí)也在不斷深入。 DGAT 作為Kennedy 途徑中唯一的限速酶[4]，深入研究其在TAG 合成和積累過(guò)程中的作用對(duì)于闡明花生油脂及其脂肪酸組成的形成機(jī)理具有重要意義。 本研究分析了前期從花生中分離的3 個(gè)DGAT 基因AhDGAT1－1、AhDGAT1－2和AhDGAT3－3在含油量和油酸含量不同的3 個(gè)花生品種中的表達(dá)情況，以期為深入探究花生油脂合成和培育高油、高油酸新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用3 個(gè)花生栽培品種分別為低油低油酸品種花育17 號(hào)、高油高油酸品種花育910 和高油低油酸品種花育918(表1)，均為本課題組培育。 2020 年5 月初種植于山東省花生研究所萊西試驗(yàn)站大田，田間水肥管理等同于常規(guī)大田，及時(shí)進(jìn)行病蟲(chóng)害防治。

表1 供試花生品種油脂和油酸含量

1.2 取樣方法

花生開(kāi)花下針后，分別采集下針后30、40、50、60 d 的莢果，剝?nèi)∽讶?圖1)，用鋁箔紙包裹，經(jīng)液氮速凍后立即放入－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 供試材料4 個(gè)發(fā)育時(shí)期的籽仁

1.3 RNA 提取與cDNA 合成

采用北京天根生化科技有限公司試劑盒(RNeasy Mini Kit)提取樣品總RNA，詳細(xì)方法參考使用說(shuō)明。 用DNaseⅠ處理提取的RNA 以去除DNA 污染。 利用Promega 的M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA 合成，每25 μL 反應(yīng)體系中加入2 μg RNA；反轉(zhuǎn)錄體系于42℃反應(yīng)1 h，之后置于冰上冷卻5 min，然后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

用SYBR Green PreMix 試劑盒(購(gòu)自MDBio臺(tái)灣生工)按使用說(shuō)明進(jìn)行。 先將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 稀釋到8 ng/μL，每反應(yīng)體系中加2 μL 稀釋后的cDNA。 熒光定量PCR 儀采用Roche 的LightCycler 2.0。 反應(yīng)程序:95℃10 s；95℃5 s，60℃30 s，72℃10 s，40 個(gè)循環(huán)；繪制熔解曲線，溫度每10 s 升高0. 5℃。 所用內(nèi)參基因?yàn)锳ctin11，所用引物見(jiàn)表2。每個(gè)樣品設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。 采用delta－delta Cp 方法分析數(shù)據(jù)，誤差線為3 次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表2 熒光定量PCR 所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 AhDGAT1－1 基因的表達(dá)分析

隨著莢果發(fā)育，AhDGAT1－1基因在3 個(gè)花生品種籽仁中的表達(dá)模式各有不同(圖2)。 花育17 號(hào)與花育910 的AhDGAT1－1基因表達(dá)量均在下針后30 天(莢果發(fā)育初期)的籽仁中最高，在下針后40 天的籽仁中最低，下針后50 天又有小幅回升。 花育918 中，AhDGAT1－1基因表達(dá)量隨莢果發(fā)育顯著升高，在莢果發(fā)育中期(下針后40天)的籽仁中表達(dá)量最高，之后表達(dá)量逐漸降低。

圖2 花生品種間AhDGAT1－1 基因表達(dá)差異分析

AhDGAT1－1基因表達(dá)量在下針后30 天和60天表現(xiàn)為花育17 號(hào)＞花育910＞花育918，而下針后40 天和50 天則表現(xiàn)為花育918＞花育17 號(hào)＞花育910。AhDGAT1－1在花育918 下針后40 天的籽仁中表達(dá)量最高，顯著高于其他時(shí)期各品種中的表達(dá)量；在花育17 號(hào)和花育910 下針后30天的籽仁中表達(dá)量也較高，與花育918 下針后50天的表達(dá)量相差較小。 說(shuō)明AhDGAT1－1可能主要在低油低油酸品種和高油高油酸品種的莢果發(fā)育初期起作用，但在高油低油酸品種中則主要在籽仁油脂積累快速期。

2.2 花生AhDGAT1－2 基因的表達(dá)分析

由圖3 可見(jiàn)，隨著莢果發(fā)育，花育17 號(hào)中Ah-DGAT1－2基因的表達(dá)量呈降低－升高－降低的變化趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在下針后30 天。 花育910 中AhDGAT1－2基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在下針后50天，其次為下針后30 天，下針后40 天的表達(dá)量最低。 花育918 中AhDGAT1－2基因的表達(dá)量隨莢果發(fā)育先逐漸升高，下針后50 天達(dá)到峰值，之后急劇下降。 3 個(gè)品種間，下針后30 天和60 天，Ah-DGAT1－2基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為花育17 號(hào)＞花育910＞花育918，品種間差異顯著；下針后40 天和50 天，AhDGAT1－2基因均在花育17 號(hào)中的表達(dá)量最高，其次為花育918，花育910 中的表達(dá)量最低，品種間差異也達(dá)顯著水平。 綜合來(lái)看，Ah-DGAT1－2基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在低油低油酸品種的籽仁充實(shí)初期，而出現(xiàn)在高油高油酸品種和高油低油酸品種的籽仁油脂積累快速期。

圖3 花生品種間AhDGAT1－2 基因表達(dá)差異分析

2.3 花生AhDGAT3－3 基因的表達(dá)分析

由圖4 可見(jiàn)，下針后30 天，AhDGAT3－3基因在花育910 中表達(dá)量最高，依次高于花育17 號(hào)和花育918；下針后40 天和50 天，花育17 號(hào)中Ah-DGAT3－3基因的表達(dá)量最高，花育918 中最低；下針后60 天，花育918 中AhDGAT3－3基因的表達(dá)量急劇升高，分別是花育17 號(hào)和花育910 表達(dá)量的4.65 倍和7.56 倍。 隨著莢果發(fā)育，AhDGAT3－3基因表達(dá)量在花育17 號(hào)和花育910 中均呈先升高后降低趨勢(shì)，均在下針后50 天達(dá)到峰值；而在花育918 中則呈持續(xù)升高趨勢(shì)，在下針后60 天達(dá)到峰值。 可見(jiàn)，AhDGAT3－3基因主要在3 個(gè)花生品種莢果發(fā)育中后期表達(dá)，說(shuō)明其可能在種子儲(chǔ)藏物質(zhì)積累方面起作用。

圖4 花生品種間AhDGAT3－3 基因表達(dá)差異分析

3 討論與結(jié)論

花生是我國(guó)重要的油料作物與經(jīng)濟(jì)作物，提高含油量是花生品種改良的主攻方向之一。 由于花生基因組測(cè)序研究起步較晚，目前從分子水平研究花生油脂合成代謝機(jī)制的還較少。 越來(lái)越多的研究表明，DGAT 在真核生物TAG 生物合成的最后一步和限速步驟中起著至關(guān)重要的作用[20－22]。 對(duì)DGAT基因的研究近幾年來(lái)在一些油料作物如高油玉米、大豆、油菜、油桐(Vernicial fordii)和向日葵(Helianthus annuus) 中相繼開(kāi)展[12，23－26]。

本研究對(duì)前期從花生中分離的3 個(gè)DGAT基因(AhDGAT1－1、AhDGAT1－2和AhDGAT3－3)在不同油脂含量的花生品種間的表達(dá)差異進(jìn)行比較，結(jié)果表明，AhDGAT1－1基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在低油低油酸品種和高油高油酸品種的莢果發(fā)育初期(下針后30 天)，而出現(xiàn)在高油低油酸品種莢果發(fā)育中期(下針后40 天)；AhDGAT1－2基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在低油低油酸品種的莢果發(fā)育初期及在高油高油酸品種和高油低油酸品種的籽仁油脂積累快速期；AhDGAT3－3基因則主要在3 個(gè)品種的莢果發(fā)育中后期表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)不同植物的DGAT 對(duì)?；舅岬孜镞x擇存在偏好性差異，致使不同物種的油脂成分不同，使特定脂肪酸在某些植物中富集，例如亞麻DGAT1 對(duì)亞麻酰CoA、油桐DGAT2 對(duì)桐酰CoA、可可(Theobroma cacao)DGAT1 對(duì)硬脂酰CoA 和花生DGAT3 對(duì)油?；鵆oA(18 ∶1 CoA)的優(yōu)先選擇[8，27－29]。 本研究結(jié)果顯示，在高油高油酸品種花育910 中AhDGAT1－1基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在莢果發(fā)育初期，對(duì)促進(jìn)花生籽仁油脂的合成有重要作用，但之后隨莢果發(fā)育表達(dá)量降低，這種降低是否與油酸含量升高有關(guān)，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。AhDGAT1－2基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在低油低油酸品種花育17 號(hào)籽仁充實(shí)初期，而在高油高油酸品種花育910 和高油低油酸品種花育918的籽仁油脂積累快速期，說(shuō)明該基因可能在種子發(fā)育中后期參與油脂與脂肪酸的合成與積累。DGAT3是一類組成型表達(dá)基因，于種子中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在擬南芥、大豆、花生種子發(fā)育中期開(kāi)始大量積累，一直延續(xù)到接近成熟階段[3，30]。 在本研究檢測(cè)的3 個(gè)花生品種中，AhDGAT3－3基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在莢果發(fā)育的中后期，也再次驗(yàn)證了前人的試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明該基因可能在種子儲(chǔ)藏物質(zhì)積累方面起作用。

花生油脂合成途徑中關(guān)鍵酶基因的篩選及功能研究，對(duì)利用分子育種手段提高花生油脂含量意義重大。 本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)了3 個(gè)DGAT基因在高、低油花生品種中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AhDGAT1－1主要在莢果發(fā)育早期起作用，而AhDGAT1－2和AhDGAT3－3主要在莢果發(fā)育中后期起作用。 本研究結(jié)果對(duì)深入理解花生油脂合成積累機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及選育高油花生品種具有一定的參考價(jià)值。