郭玉鴿，張倩，楊惠娟，李俊營，常棟，張富生，武兆云，閻海濤，楊鐵釗

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南鄭州 450002；2. 河南省煙草公司平頂山市公司，河南平頂山 467000)

由黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)引起的花葉病是煙草上的重要病害，嚴重影響煙葉質(zhì)量[1，2]。 黃瓜花葉病毒是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，為三分體正義單鏈RNA 病毒[3]，編碼5 種蛋白[4]。 RNA1 編碼1a 復制酶蛋白[5]；RNA2 的5′端編碼2a 復制酶蛋白，3′端編碼2b 蛋白[6]。 前人研究發(fā)現(xiàn)植物受CMV 侵染后的癥狀表現(xiàn)是由1a 和2a 復制酶蛋白共同決定的，二者具有協(xié)同作用[7]。 RNA3 的5′端編碼胞間運動蛋白(MP)，3′端編碼外殼蛋白(CP)，與病毒擴散、長距離運輸和包被作用有關[8]。 目前生產(chǎn)上防治煙草黃瓜花葉病毒病通常以化學防治為主，容易造成藥劑殘留和環(huán)境污染等問題[9，10]。 培育抗病品種也是防治煙草黃瓜花葉病的有效方式之一[11]，但至今還沒有從煙草上克隆出CMV 抗性基因[12]，育種工作進展緩慢，而生物防治技術已經(jīng)逐漸成為病害防治的新方法[13]。

病毒誘導基因沉默(virus－induced gene silence，VIGS)是一種對植物進行反向遺傳操作的技術[14]，是植物防御機制的表現(xiàn)[15]。 農(nóng)桿菌介導的VIGS 技術通過農(nóng)桿菌將攜帶目的基因片段的病毒載體轉移到植物細胞中[16]，介導靶向同源基因的mRNA 降解，引起目的基因沉默[17]。 煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus， TRV)載體是使用最廣泛的VIGS 載體，具有沉默效率高、持久性長、不會對宿主造成明顯傷害等優(yōu)點[18]。 目前VIGS 技術多用于基因功能鑒定和抗病抗蟲[19，20]研究上:如龔攀[21]構建的甜菜VIGS 體系驗證了抗旱相關基因功能；劉天波等[22]沉默馬鈴薯Y 病毒脈壞死株系外殼蛋白基因有效防治馬鈴薯Y病毒病。 有研究表明，CMV 在不同作物中起關鍵作用的基因是不同的[23]。 因此本研究根據(jù)CMV基因組及其編碼蛋白的組成特征，構建靶向相關基因片段的TRV 載體，比較煙株接種VIGS 載體后對CMV 的抗性，以期篩選適用于大田防治煙草黃瓜花葉病的最佳VIGS 體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年4—5 月進行。 參試烤煙品種為中煙100，由河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院育種實驗室提供。 pTRV2 載體購自武漢淼靈生物科技有限公司，根癌農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司。 CMV 病毒葉片由河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院育種實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)已測定的CMV(GenBank登錄號:GCA＿000864745.1)序列，選取適合用來構建VIGS 載體的片段，使用Oligo 7 軟件設計特異性引物，其序列如表1 所示。

表1 本研究使用的引物序列

1.2.2 VIGS 載體的構建 利用TRIzol 法提取感染了CMV 病毒的煙葉總RNA，參照北京全式金生物技術有限公司TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說明書反轉成cDNA。 以獲得的cDNA 為模板，按照表1 引物利用諾唯贊生物技術有限公司的P505 高保真酶進行PCR 擴增。 擴增體系:2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL，Phanta Max Super－Fidelity DNA Polymerase 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA(20 μmol/L)模版1 μL，ddH2O 補至50 μL。 反應條件:95℃預變性3 min；95℃變性15 s，68℃退火15 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃終延伸5 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收目的片段。 對pTRV2 空載體質(zhì)粒進行EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后獲得線性化載體。將擴增產(chǎn)物與線性化載體進行連接，隨后轉化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞。 將測序正確的單克隆菌株擴繁并提取質(zhì)粒保存。

1.2.3 重組表達載體轉化 參照上海唯地生物技術有限公司的農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細胞的使用說明書，將重組表達載體pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMV－MP 和pTRV2－CMV－CP 轉化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細胞。 將菌液均勻涂抹在LB(含有濃度為25 mg/mL 利福平和50 mg/mL 卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，28℃下倒置培養(yǎng)48 h；挑取單菌落經(jīng)PCR 擴增后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后分別擴繁。

1.2.4 農(nóng)桿菌轉化煙草 將pTRV1、pTRV2、pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMVMP 和pTRV2－CMV－CP 分別接種到LB 液體培養(yǎng)基上，28℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)后，調(diào)整濃度OD600值為0.8 ～1.0，用pTRV1 分別與pTRV2、pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMV－MP和pTRV2－CMV－CP 等比混合，離心后棄上清液，將沉淀重懸于等體積的侵染緩沖液(50 mmol/L MgCl2、50 mmol/L MES、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮)中。 選取長勢均勻一致的六葉一心煙苗，用1 mL注射器注射侵染液于煙株嫩葉背面，每株煙注射2 片葉，每片葉注射1 mL。

1.3 試驗設計

共設置6 個處理，分別為CK:不注射煙株；空載:注射接種含pTRV2 的侵染液(空載體對照)；C1:注射接種含pTRV2－CMV－1a 的侵染液；C2:注射接種含pTRV2－CMV－2a 的侵染液；C3:注射接種含pTRV2－CMV－MP 的侵染液；C4:注射接種含pTRV2－CMV－CP 的侵染液。 每個處理注射接種20 株煙，每株煙接種2 mL，接種載體后14 d各處理均用金剛砂摩擦接種CMV 病毒。

1.4 測定指標

1.4.1 VIGS 載體接種效果及基因沉默效果的測定 在接種VIGS 載體后10 d，各處理隨機選擇兩株煙，取新長出的葉片，充分消毒后提取RNA，按照表1 中TRV2 擴增引物進行RT－PCR 檢測。在接種病毒后7、14、21 d 時，各處理分別選擇3株煙，取心葉向下第二片葉，充分消毒后提取RNA，反轉錄成cDNA，以煙草26S rRNA 為內(nèi)參基因，根據(jù)GenBank 發(fā)布的相關基因序列設計擴增引物(表2)。 按照Quant qRT－PCR kit (SYBR Green，TIANGEN 公司)使用說明在StepOneTMReal－Time PCR 儀(Life technologies 公司)上進行qRT－PCR 檢測。 根據(jù)已得到的Ct 值，采用2－ΔΔCt法分析CMV 和TRV 基因的相對表達量。 基因沉默效率(%)計算公式:(對照組CMV 累積量－處理組CMV 累積量)/對照組CMV 累積量×100。

表2 qRT－PCR 所用引物

1.4.2 病毒濃度的測定 在接種病毒后30 d，各處理選擇發(fā)病情況一致的3 株煙，取心葉向下第二片葉，液氮速凍后保存于冰箱，使用黃瓜花葉病毒(CMV)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定煙株內(nèi)CMV 病毒濃度。

1.4.3 發(fā)病情況的測定 在接種病毒后第7 天觀察發(fā)病情況。 根據(jù)《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》(GB/T 23222—2008)以株為單位進行病級鑒定，根據(jù)下列公式計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

發(fā)病率(%)＝發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100 ；

病情指數(shù)＝(Σ 各級病株數(shù)×病級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級代表值)×100 ；

防治效果(%)＝(對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100 。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(Duncan′s)，采用Microsoft Excel 2007 整理分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 VIGS 載體構建

由圖1 可知，PCR 擴增得到的基因片段大小與表1 一致。 分別將這些基因片段同pTRV2 的線性化載體相連接，獲得對應的表達載體，將測序正確的表達載體轉化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細胞。

圖1 目的基因的PCR 擴增

2.2 VIGS 載體接種效果

以TRV2－F/TRV2－R 為引物，進行RT－PCR檢測(圖2)，產(chǎn)物大小約為744 bp，說明VIGS 載體成功導入煙株。

圖2 VIGS 載體接種煙株后的RT－PCR 檢測

2.3 基因沉默效果分析

從圖3 可以看出，空載體處理的CMV 相對表達量在接種病毒后7 d 和21 d 與對照相比有一定程度的降低。 接種病毒7 d 后，C2 處理的CMV相對表達量最低，基因沉默效率最高，為46.25%；接種病毒14 d 后，空載體處理的病毒相對表達量較對照有一定程度的升高，C2 和C3 處理的病毒相對表達量均顯著低于對照，基因沉默效率分別為39.38%和26.24%；接種病毒21 d 后，接種載體的處理CMV 相對表達量均顯著低于對照和空載體處理，C2 處理基因沉默效率仍最高，為36.8%，C4 處理次之。

圖3 接種病毒后CMV 相對表達量

從圖4 可以看出，TRV 相對表達量不同處理間差異顯著，C2 處理的TRV 表達量顯著高于空載體處理，C4 次之，C1 最少。

圖4 接種病毒后TRV 相對表達量

2.4 基因沉默后病毒濃度

接種病毒30 d 后，各處理CMV 濃度表現(xiàn)出與CMV 相對表達量相似的變化趨勢，C2、C3、C4處理的CMV 濃度均顯著低于對照和空載體處理。其中C2 處理的病毒濃度最低，僅為對照的72.8%；C4 次之，病毒濃度為對照的86.5%；C3 處理為對照的91.3%(圖5)。

圖5 接種病毒后30 d CMV 濃度變化

2.5 基因沉默后抗病效果分析

由表3 可知，發(fā)病初期C2 處理的發(fā)病率、病情指數(shù)最低，防治效果最好；C4 處理次之；空載體的發(fā)病情況略輕于對照。 發(fā)病高峰期，除C2 處理發(fā)病率為95%外，其它處理的發(fā)病率均為100%，C2 的病情指數(shù)最低，防治效果最好。

表3 不同處理的發(fā)病情況

3 討論

Waterhouse 等[24]將馬鈴薯Y 病毒蛋白酶基因片段轉入煙草中，獲得抗馬鈴薯Y 病毒的轉基因煙草。 程英豪等[25]將黃瓜花葉病毒(CMV)外殼蛋白轉入煙草，獲得的轉基因煙草對CMV 抗性增強。 目前煙草的大多數(shù)抗病毒研究都是通過將病毒的外殼蛋白基因導入煙草來提高抗性[26，27]，該過程會產(chǎn)生病毒蛋白，因此其安全性存在爭議[28]。 病毒誘導的基因沉默(VIGS)屬于轉錄后水平的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)，利用植物固有的RNA 干擾和病毒免疫應答機制[29]，避免了翻譯為蛋白的安全性問題。 目前VIGS 技術已成功應用到病蟲害防治中，也被稱為寄主誘導的基因沉默(host－induced gene silencing，HIGS)。 Nowara 等[30]首次發(fā)現(xiàn)，將病原體基因導入病毒載體并感染寄主植物后，寄主植物細胞中會產(chǎn)生dsRNA，并在病原體感染寄主時進入病原體中，從而引發(fā)病原體發(fā)生PTGS。前人將線蟲基因片段導入TRV 載體后侵染擬南芥，成功抑制了根部寄生線蟲體內(nèi)目標基因的表達[31]。

基因沉默的關鍵是找到起關鍵作用的靶標基因。 CMV 的1a 和2a 蛋白共同組成RNA 聚合酶，并與寄主因子結合形成復合物，在病毒的復制中起作用[32]。 位于胞間連絲的胞間運動蛋白(MP)參與了CMV 的胞間運轉和系統(tǒng)運轉[33]。 外殼蛋白(CP)是一個多功能蛋白，其主要功能是組裝病毒，此外該蛋白還是關鍵的致病因子，參與復制、翻譯、運動、蚜傳等多個過程[34]。 由于CMV 在不同作物中起關鍵作用的基因不同，因此本研究分別在CMV 的4 個關鍵蛋白上構建VIGS 載體。

本研究建立的VIGS 體系中CMV－2a(C2)的基因沉默效果最好，接種病毒后7 d 基因沉默效率最高，病毒累積量最低。 這與前人的研究結果相似:將CMV 的2a 基因轉化入煙草，獲得的煙草植株發(fā)病率降低，發(fā)病時間推遲[35]。 此外，空載體處理的CMV 累積量與對照相比也有所下降，接種病毒后21 d 達到顯著性差異。 前人研究認為病毒是植物的應激因素，推測接種空載體后引起了植物一系列的防御反應[36]，抑制了CMV 病毒在煙株內(nèi)的傳播。 接種病毒30 d 后，C2 處理的CMV 病毒濃度最低，即CMV－2a VIGS 載體對CMV 的抑制作用最好，且TRV 載體的含量在各處理中最高。 C2 處理發(fā)病初期的發(fā)病率最低，僅為對照的40%，發(fā)病時間推遲，有效抑制了CMV在煙株內(nèi)的傳播。

通過VIGS 技術沉默CMV－2a 基因可以很好地防治煙草黃瓜花葉病，下一步將進行大規(guī)模田間試驗，為后期大田應用提供理論基礎。 VIGS 技術具有成本低、方法操作簡單等優(yōu)點[37]，并且對植物無傷害，對環(huán)境無污染，是一種具有較好應用前景的方法。 然而溫度是限制VIGS 技術應用的主要因素[38]，因此開發(fā)出耐高溫的載體是VIGS技術未來需要努力的重點和方向。

4 結論

本研究建立的CMV－2a VIGS 體系能夠有效沉默外源侵入的CMV 基因的表達，基因沉默效率高達46.25%，有效抑制了CMV 在煙株內(nèi)的傳播，發(fā)病時間推遲，防治效果最好，為防治煙草黃瓜花葉病毒病提供了新的思路與方法。