何鑫柱，李潮俊，周孟焦，康 明，梁曉峰

（1. 四川中醫(yī)藥高等專科學校川西北中藥材資源研究與開發(fā)利用實驗室，四川 綿陽 621010；2．西南科技大學材料與化學學院，四川 綿陽 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC.） 為蕓香科花椒屬植物，又名藤椒、野花椒、蜀椒和山花椒等，近年來因其對生長環(huán)境要求低、易種植、產(chǎn)量大等特點已經(jīng)成為鄉(xiāng)村振興中備受關注的重要經(jīng)濟作物，廣泛分布在四川、甘肅、陜西和云南等地區(qū)[1]。竹葉花椒傳統(tǒng)主要用于調(diào)味品，也可用作中藥，在《本草圖經(jīng)》中有專門記載。竹葉花椒果皮中含有黃酮類、揮發(fā)油、酰胺和生物堿等多種活性成分[2]。藥理學研究表明，黃酮類物質(zhì)具有較強抗氧化活性[3]，可作為天然抗氧化劑研究的原材料。竹葉花椒中黃酮類化合物成分復雜，其抗氧化活性物質(zhì)基礎研究還不夠深入。運用譜效關系學的方法對其抗氧化活性的物質(zhì)基礎進行分析[4]，通過研究共有特征峰的相似度和抗氧化活性特點，構(gòu)建竹葉花椒黃酮類物質(zhì)化學指紋圖譜和抗氧化活性之間的關系，可用于評價和預測不同來源竹葉花椒的抗氧化活性[5]。

通過建立竹葉花椒黃酮類物質(zhì)的HPLC 指紋圖譜，利用DPPH 法測試其抗氧化性，運用偏最小二乘回歸法考查其抗氧化活性的譜效關系，為深入研究竹葉花椒黃酮類抗氧化的活性物質(zhì)基礎、開發(fā)天然抗氧化劑提供了試驗參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、紫云英苷、異鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚對照品，阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；甲醇、石油醚和無水乙醇，均為分析純，成都市科隆化學品有限公司提供；過硫酸鉀、DPPH（1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼），國藥集團化學試劑有限公司提供；聚酰胺和D101 型大孔吸附樹脂，上海麥克林生化科技提供。10 批不同來源的竹葉花椒，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等?？茖W校江洪波教授鑒定為蕓香科花椒屬植物竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC.） 的果皮。

10 批次竹葉花椒來源信息見表1。

表1 10 批次竹葉花椒來源信息

1.2 儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀，美國賽默飛公司產(chǎn)品；752 N-Plus 型紫外可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；Sartorius BSA124S 型分析天平，賽多利斯科學儀器產(chǎn)品；RE52CS-2 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器產(chǎn)品；YTLG-12A 型冷凍干燥機，上海葉拓科技有限公司產(chǎn)品；XH-MC-1 型實驗室微波合成儀，北京祥鵠科技產(chǎn)品；DHG-9075A 型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器產(chǎn)品。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉花椒黃酮的抗氧化活性測試

2.1.1 供試品溶液的制備

稱取竹葉花椒果皮粉末適量，加入1∶30（g∶mL） 的60%乙醇水溶液，用微波輔助法進行提取，于80 ℃下反應25 min，提取液用石油醚進行脫脂處理[7]，再冷凍干燥得到黃酮粗提物，用聚酰胺-大孔吸附樹脂對提取物進行純化，得到淡黃色粉末狀固體黃酮化合物。精密稱取黃酮純化物5.0 mg，加入乙醇溶解，用10 mL 容量瓶定容，配制成0.5 mg/mL的樣品溶液，再將其分別配制質(zhì)量濃度為0.005，0.010，0.020，0.040，0.080 mg/mL 的樣品溶液。

2.1.2 DPPH·溶液的配制

DPPH（1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼） 是一種穩(wěn)定的含氮自由基。在DPPH·清除試驗中，黃酮類化合物等抗氧化劑能提供氫原子與DPPH·相結(jié)合，從而導致溶液中的自由基減少，吸光度大小會發(fā)生變化，在波長517 nm 處測其吸光度變化大小來評價受試物清除DPPH·的能力。精密稱取7.9 mg 的DPPH固體粉末，加入乙醇溶解，用100 mL 容量瓶定容，配成濃度為2×10-4mol/L 的DPPH·溶液。

2.1.3 DPPH·清除率的測定

利用紫外分光光度計，在波長517 nm 處測試2 mL乙醇和DPPH·混合溶液2 mL、受試物2 mL 和DPPH·混合溶液2 mL、乙醇2 mL 和受試物混合溶液2 mL 的吸光度，分別記為A0，A1和A2；測試前需在暗處反應30 min，進行3 次平行試驗，清除率計算公式如下：

2.1.4 抗氧化活性測試結(jié)果

應用IBM SPSS Statistics 25 軟件進行Probit 回歸分析，預測出受試物的IC50。IC50表示樣品清除一半自由基的溶液濃度，IC50值越小，說明受試物對自由基清除效果越好，其抗氧化能力越強。DPPH 法測定10 批次竹葉花椒黃酮抗氧化的IC50值結(jié)果。

10 批次竹葉花椒黃酮抗氧化的IC50值見表2。

表2 10 批次竹葉花椒黃酮抗氧化的IC50 值 /μg·g-1

由表2 可知，10 批次竹葉花椒黃酮清除DPPH·的能力大小為S2>S8>S3>S5>S9>S4>S6>S10>S1>S7。

2.2 竹葉花椒黃酮類物質(zhì)的HPLC 指紋圖譜

2.2.1 供試品溶液的制備

2.2.2 對照品溶液的配制

精密稱取竹葉花椒黃酮純化物5.0 mg，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，即得供試品溶液。

精密稱取表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮苷、異鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚7 個對照品適量，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，配成混合對照品溶液。

2.2.3 HPLC 測試條件

色譜柱為反相PA2 C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為甲醇溶液；梯度洗脫（0~1 mim，5% B；1~3 min，5%~10% B；3~16 min，10%~90% B；16~22 min，90%B；22~22.1 min，90%~5% B；22.1~30 min，5% B）；柱溫25 ℃，進樣量30 μL，檢測波長300 nm，流速1 mL/min。

2.2.4 精密度試驗

取同一批竹葉花椒黃酮純化物為考查對象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色譜條件重復測試一供試品溶液5 次，計算它們共有峰峰面積的標準偏差（RSD）。結(jié)果各共有色譜峰的相對峰面積的RSD 值為0.61%~2.90%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批竹葉花椒黃酮純化物為考查對象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色譜條件對一供試品溶液在0，4，8，12，24 h 時進行測試，計算它們共有峰峰面積的RSD。結(jié)果各共有色譜峰的相對峰面積RSD 值在0.23%~2.53%，表明樣品溶液在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復性試驗

取同一批竹葉花椒黃酮純化物為考查對象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色譜條件對5 組平行供試品溶液進行測試，計算它們共有峰峰面積的RSD。結(jié)果各共有色譜峰的相對峰面積RSD 值在0.44%~2.43%，表明建立的HPLC 測試方法具有良好的重復性。

2.2.7 竹葉花椒黃酮HPLC 的疊加指紋圖譜

將10 批次竹葉花椒黃酮的HPLC 圖譜導入相似度評價軟件中，對其HPLC 指紋圖譜進行解析，生成一個對照指紋圖譜（R） 和HPLC 共有疊加指紋圖譜。

10 批次竹葉花椒黃酮樣品的疊加指紋圖譜見圖1，混合對照品和竹葉花椒黃酮對照的指紋圖譜見圖2；10 批次竹葉花椒黃酮的共有峰峰面積見表3。

圖1 10 批次竹葉花椒黃酮樣品的疊加指紋圖譜

圖2 混合對照品和竹葉花椒黃酮對照的指紋圖譜

表3 10 批次竹葉花椒黃酮的共有峰峰面積

由圖2 可知，10 批次竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜共指認出16 個特征共有峰，其中峰5，11，12，13，14，15 和16 代表的化合物分別為表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮苷、異鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚。每一個HPLC 指紋圖譜中共有色譜峰的面積之和大于總面積的90%，表明該HPLC 指紋疊加圖譜符合指紋圖譜的評價要求，能用于竹葉花椒黃酮的譜效關系研究。

2.3 竹葉花椒黃酮抗氧化的譜效關系

采用偏最小二乘回歸（PLSR） 法分析竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積與DPPH 法得到的抗氧化IC50值之間的關系。

DPPH 法的PLSR 方程的回歸系數(shù)和VIP 值見圖3。

圖3 DPPH 法的PLSR 方程的回歸系數(shù)和VIP 值

通過SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，得到的PLSR 方程為：

Y=0.010X1+0.002X2-0.014X3+0.084X4-0.266X2-0.121 X6+0.084X7-0.117X8-0.145X9+0.101X10+0.232 X11-0.075X12-0.150X13+0.159X14+0.072 X15-0.427X16.

16 個共有峰中的峰3，5，6，8，9，12，13 和16 對應的回歸系數(shù)為負值，表明這些共有峰的峰面積越大，IC50值就越低，即清除DPPH·的能力越強。變量投影重要性值（VIP） 是PLSR 分析中一個重要的指標，VIP 值越大，表明該活性成分對藥效的貢獻率越大；當VIP 值> 1 時，表明該活性成分對藥效呈顯著相關。在DPPH 法的PLSR 分析中，VIP 值>1 的共有峰有峰1，2，4，5，6，7，9，12，13 和16，表明這些共有峰代表的化合物與竹葉花椒黃酮抗氧化活性的大小呈顯著相關。結(jié)合PLSR 方程的回歸系數(shù)和VIP 值，表明5，6，9，12，13 和16 對抗氧化活性的貢獻值較大，這6 個共有峰代表的化合物是竹葉花椒黃酮抗氧化的主要活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

利用DPPH 法對竹葉花椒黃酮提取物的抗氧化活性進行測試，并建立了10 批次不同來源竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜，用偏最小二乘回歸法分析了竹葉花椒黃酮抗氧化的譜效關系。通過相似度評價軟件對10 批次竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜進行解析，得到其疊加指紋圖譜，共指認出16 個共有色譜峰；峰5（表兒茶素）、6、9、12（金絲桃苷）、13（紫云英苷） 和16（山奈酚） 這6 個共有峰所代表的化合物是竹葉花椒黃酮抗氧化的主要活性成分。