譚 洪 ，殷和佳 ，李 妍 ，胡 琴 ，李 斕 ，任遵丹 ，石 柔

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌二科，云南 昆明 650032;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)，2021 年全球有5.37億人患有糖尿?。╠iabetes mellitus，DM），預(yù)計(jì)到2045 年將增加到7.84 億[1]。DM 會(huì)導(dǎo)致多種慢性并發(fā)癥，其中糖尿病腎臟疾?。╠iabetic kidney disease，DKD）是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率約20%～40%[2]。氧化應(yīng)激是內(nèi)皮功能障礙的重要發(fā)病機(jī)制之一，是DKD 的標(biāo)志性特征[3]。在DKD 患者中發(fā)現(xiàn)到與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的高水平的非對(duì)稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine ADMA）[4]。二甲基精氨酸二甲胺水解酶1（dimethyl arginine dimethylamine hydrolase 1 DDAH1）是ADMA 代謝的關(guān)鍵酶，其基因多態(tài)性與ADMA水平及氧化應(yīng)激相關(guān)[5]，但與DKD 的關(guān)系尚不明確。本研究的目的為探討DDAH1 基因836A/T 多態(tài)性與云南地區(qū)漢族2 型糖尿病腎臟疾病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

均符合1999 T2DM 診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：民族為漢族，籍貫為云南省，在云南居住10 a 以上，相互間無親緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：其它疾病引起的蛋白尿及腎功能不全、合并嚴(yán)重肝功能不全、糖尿病酮癥、感染性疾病、妊娠者。選取2017年5 月至2019 年2 月期間到昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的T2DM 患者共660 例，男334 例，女326 例，平均年齡（55.87±11.45）歲。根據(jù)隨機(jī)尿尿白蛋白/肌酐比值（UACR）分為單純2 型糖尿病組（DN0 組，UACR ≤ 30 μg/mg），合并早期腎病組（DN1 組，UACR 30～299 μg/mg），合并臨床期腎病組（DN2 組UACR ≥ 300 μg/mg），合并腎病組（DN1+DN2 組）。同時(shí)納入同期昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康人群（NC 組），共304 例，男154 例，女150 例，年齡（54.62±10.58）歲。無糖尿病、高血壓家族史，且經(jīng)糖耐量試驗(yàn)排外糖尿病。所有研究對(duì)象均為云南區(qū)域無親緣關(guān)系的漢族。研究方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有樣本采集均需知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DDAH1基因836A/T 多態(tài)性分析方法研究對(duì)象外周靜脈血中DNA 的抽提采用全血基因DNA 提取試劑盒提取。之后以特定的引物（通用生物系統(tǒng)有限公司合成）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）[7]，引物序列見表1。將純化后的PCR 產(chǎn)物在3730xl 型測(cè)序儀上進(jìn)行DNA 測(cè)序，得到3種基因型（圖1～圖3）。

圖1 DDAH1 基因836AA 基因型對(duì)應(yīng)的測(cè)序圖Fig.1 DDAH1 gene 836AA genotype sequencing

圖2 DDAH1 基因836TT 基因型對(duì)應(yīng)的測(cè)序圖Fig.2 DDAH1 gene 836TT genotype sequencing

圖3 DDAH1 基因836AT 基因型對(duì)應(yīng)的測(cè)序圖Fig.3 DDAH1 gene 836AT genotype sequencing

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.2 臨床及生化指標(biāo)檢測(cè)檢測(cè)血肌酐、尿酸、血脂、UACR（均采用貝克曼庫爾特AU5800 全自動(dòng)生化分析儀），用高效液相法測(cè)定糖化血紅蛋白（HBA1C）含量，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國 RD）測(cè)定血漿ADMA 水平。測(cè)量血壓。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析選擇SPSS19.0 軟件。用哈迪-溫伯格遺傳平衡定律檢驗(yàn)樣本的人群代表性。計(jì)量資料以表示，各組間采用單因素方差分析進(jìn)行比較。計(jì)數(shù)資料以n（%）描述，各組間等位基因和基因型頻率的差異采用χ2檢驗(yàn)分析。采用Logistic 回歸分析T2DM 發(fā)生DKD 的危險(xiǎn)因素。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間臨床資料比較

病程、SBP、LDL-C、ADMA 在DN1+DN2 組高于DN0 組。為排除混雜因素對(duì)結(jié)果的干擾，進(jìn)一步行協(xié)方差分析，兩組間病程、ADMA 差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。病程、SBP、血肌酐、尿酸在DN2 組高于DN1 組、為排除混雜因素對(duì)結(jié)果的干擾，進(jìn)一步行協(xié)方差分析，病程、SBP在兩組間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表2。

表2 各組間臨床資料比較（）Tab.2 Comparison of clinical data of each group（）

表2 各組間臨床資料比較（）Tab.2 Comparison of clinical data of each group（）

與NC組比較，* P ＜ 0.05；與DN0組比較，△P ＜ 0.05；與DN1組比較，#P ＜ 0.05；協(xié)方差分析，▲P ＜ 0.05。

2.2 各組間DDAH1 基因836A/T 多態(tài)性比較

AA 基因型頻率：DN1+DN2 組高于DN0 組，差異顯著（P＜ 0.05）。A 等位基因頻率：DN1 +DN2 組高于DN0 組，差異顯著（P＜ 0.05）。但AA、AT+TT 基因型頻率、A 等位基因頻率在DN1 和DN2 組間無顯著性差異（P＞ 0.05），見表3。

表3 各組間基因型頻率和等位基因頻率[n（%）]（1）Tab.3 The genotype and allele frequencies in each group [n（%）]（1）

2.3 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較

在T2DM 患者中，DDAH1 基因836AA 基因型攜帶者較AT+TT 基因型個(gè)體具有更高的ADMA水平（P＜ 0.05），見表4。

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（1）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（1）

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（1）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（1）

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（2）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（2）

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（1）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（1）

2組間比較，*P ＜ 0.05。

2.4 T2DM 患者發(fā)生DKD 的危險(xiǎn)因素分析

以2 型糖尿病患者發(fā)生DKD 與否（發(fā)生=1，不發(fā)生=0）作為因變量，將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量（基因型、收縮壓、血肌酐、尿酸、甘油三酯、低密度脂蛋白、糖化血紅蛋白、ADMA 水平、病程）為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，在2 型糖尿病患者中病程、ADMA、DDAH1 基因836 位點(diǎn)AA 基因型是DKD發(fā)生的危險(xiǎn)因素（表5）。以2 型糖尿病患者DKD發(fā)展與否（發(fā)展=1，不發(fā)展=0）作為因變量，選擇上述各項(xiàng)指標(biāo)作為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，在2 型糖尿病患者中病程、SBP 是DKD 發(fā)展的危險(xiǎn)因素，DDAH1 基因836位點(diǎn)基因多態(tài)性不是DKD 發(fā)展的危險(xiǎn)因素（表6）。

表5 T2DM-DKD 發(fā)生的危險(xiǎn)因素的Logistic 分析Tab.5 Logistic regression analysis of T2DM-DKD occurence

表6 T2DM-DKD 發(fā)展的危險(xiǎn)因素的Logistic 分析Tab.6 Logistic regression analysis of T2DM-DKD development

3 討論

DKD 是T2DM 微血管病變的致命表現(xiàn)之一，同時(shí)也是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎臟疾病發(fā)生及死亡的主要原因[8]。以一氧化氮（NO）生物利用度降低和氧化應(yīng)激升高為特征的內(nèi)皮功能障礙是糖尿病和DKD 的顯著特征[9]。ADMA 是一種內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制劑，影響NO 的水平，參與氧化應(yīng)激及內(nèi)皮功能障礙。近期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病前期和T2DM 患者的ADMA 濃度均顯著升高[10]。蛋白尿是DKD 最重要的臨床標(biāo)記物之一，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明，ADMA 升高與重度蛋白尿相關(guān)[11]。與此同時(shí)在動(dòng)物模型和糖尿病微血管病變（如視網(wǎng)膜病變、腎病和神經(jīng)病變）患者中也檢測(cè)到ADMA 升高[12]。一項(xiàng)meta 分析也提示，DM合并蛋白尿患者ADMA 明顯升高，ADMA 可能在包括DKD 在內(nèi)的糖尿病微血管并發(fā)癥的病理生理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[13]。來自印度的一項(xiàng)臨床研究結(jié)果表明，ADMA 有可能成為DKD 的預(yù)測(cè)因子[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在云南地區(qū)漢族2 型糖尿病患者中，合并DKD 患者較未合并DKD 患者ADMA水平升高，但在DKD 亞組（DN1、DN2）間ADMA濃度無差異。行相關(guān)危險(xiǎn)因素分析后，提示ADMA 是DKD 發(fā)生的危險(xiǎn)因素。提示ADMA 作為氧化應(yīng)激的重要刺激因子，對(duì)DKD 的發(fā)生可能起重要作用，但對(duì)DKD 病情進(jìn)展可能不是主要的促進(jìn)因素。

DDAH 通過降解ADMA 來維持NO 的生物利用度。DDAH 的兩種亞型（DDAH-1 和DDAH-2）由兩種不同的基因編碼，具有不同的組織分布。盡管2 者都在腎臟中表達(dá)，主要在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、致密斑和小管細(xì)胞中[15]，但DDAH-1 是降解ADMA 的關(guān)鍵同工酶[3]。在健康和糖尿病小鼠中發(fā)現(xiàn)缺乏DDAH1 導(dǎo)致血漿ADMA 水平顯著升高[16]。DDAH1 缺乏可促進(jìn)腎近端小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并在糖尿病腎臟中引起纖維化和氧化應(yīng)激[17]。而纖維化和氧化應(yīng)激都是DKD 的顯著病理生理特征。Michael DW 等[3]報(bào)道，DKD 與腎臟中ADMA 增加和DDAH 活性及DDAH1 表達(dá)降低相關(guān)，使用腺病毒載體在腎內(nèi)過表達(dá)DDAH1 可顯著減少腎損傷。上述研究結(jié)果提示，DDAH1 可能通過對(duì)ADMA 的調(diào)節(jié)影響DKD 的發(fā)生。DDAH1 基因序列變異與血清ADMA濃度密切相關(guān)[18-19]。國外學(xué)者研究了編碼ADMA代謝相關(guān)酶DDAH1 的基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)DDAH1 rs233112，rs669173、rs7521189、rs2474123 和rs13373844 幾個(gè)單核苷酸多態(tài)性與ADMA 水平密切相關(guān)[18,20]。還有一些報(bào)道提示DDAH1 基因變異與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)。例如：DDAH1 啟動(dòng)子-396_-395插入等位基因（GCGT）增加男性T2DM 患病風(fēng)險(xiǎn)[21]。DDAH1 rs233109 CC 純合子的患者比攜帶TT 純合子的患者更容易發(fā)生糖尿病大血管病變[22]。但目前有關(guān)DDAH1 基因多態(tài)性與DKD 關(guān)系的研究報(bào)道罕見。本研究通過對(duì)云南地區(qū)漢族T2DM 患者DDAH1 基因836 多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)攜帶AA 基因型的患者更容易發(fā)生DKD，并且該基因型攜帶者ADMA 水平升高。但在DKD 亞組（DN1、DN2）間沒有發(fā)現(xiàn)該基因位點(diǎn)的遺傳差異。相關(guān)危險(xiǎn)因素分析顯示DDAH1 基因836 位點(diǎn)AA 基因型是T2DM 發(fā)生DKD 的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，在云南地區(qū)漢族2 型糖尿病患者中，ADMA 水平升高可能增加DKD 發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。DDAH1 基因836 多態(tài)性與DKD 的發(fā)生相關(guān)，AA基因型可能通過調(diào)控DDAH1 的表達(dá)和活性，增加ADMA 的濃度，從而促進(jìn)DKD 的發(fā)生。然而在DKD 患者中ADMA 升高的確切機(jī)制尚不完全清楚。未來應(yīng)對(duì)ADMA 進(jìn)行連續(xù)測(cè)定的前瞻性研究以進(jìn)一步證實(shí)ADMA 作為DKD 的生物標(biāo)志物及致病因素的因果關(guān)系。另一方面，本研究樣本量有限，而且影響DDHA1 基因表達(dá)的位點(diǎn)不止1個(gè)，當(dāng)其它位點(diǎn)變異時(shí)可能增強(qiáng)或減弱836 位點(diǎn)變異的作用。因此，今后還應(yīng)進(jìn)一步增加樣本量，同時(shí)聯(lián)合DDHA1 基因其他位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)研究，并結(jié)合動(dòng)物模型及體外實(shí)驗(yàn)輔以功能實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步揭示DDHA1 基因遺傳多態(tài)性與DKD 的內(nèi)在關(guān)系。