王禹雪，張華莉，陳理軍，陸永萍

（云南大學附屬醫(yī)院超聲科，云南 昆明 650021）

九十年代初期的研究表明，在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）形成過程中，動脈內(nèi)膜和外膜層聚集著肥大細胞（mast cells，MCs），首次提出MCs 參與AS 進程[1]。

血管的微環(huán)境一旦發(fā)生變化，炎性細胞便會從血管外膜的滋養(yǎng)血管中滲出，參與疾病的變化[2-3]。MCs 激活時釋放出來的趨化因子、細胞因子、組胺、白三烯等炎癥因子[4]使血管的通透性增加，導致單核巨噬細胞和淋巴細胞聚集到斑塊處[5]，釋放出大量的中性蛋白酶，可以加速低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）進入到血管內(nèi)膜局部并聚集[6]，促進AS 斑塊形成。

在骨髓細胞向MCs 分化及活化過程中白細胞介素3（interleukin-3，IL-3）和干細胞因子（stem cell factor，SCF）起到重要作用[7-8]。本研究旨在通過提取乳兔骨髓細胞，利用IL-3、SCF、β-巰基乙醇聯(lián)合作用誘導培養(yǎng)骨髓來源肥大細胞并鑒定其純度與活性，為進一步研究肥大細胞與AS 的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

IL-3、SCF（美 國Peprotech 公 司）；FBS、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640（美 國Gibco 公司）；實驗動物：2 周齡乳兔，昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，環(huán)境條件符合國家實驗動物環(huán)境及設施標準要求，室內(nèi)保持安靜、清潔、干燥和通風。自由飲水。實驗動物使用許可證號：SCXK（滇）2015-0002。

1.2 方法

1.2.1 兔骨髓細胞的獲取麻醉：（經(jīng)2 周齡乳兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，1 mL/kg）→浸泡（75%C2H5OH，10 min）→剝離（后肢皮膚切開，逐層分離，剝離肌肉）→暴露股骨→取出→浸泡（75% C2H5OH 的無菌培養(yǎng)皿中浸泡3～5 min）→股骨兩端剪去→吹打骨髓（吸取DMEM 高糖培養(yǎng)基后吹打骨髓，股骨變白）→獲取細胞（1 000 r/min，5 min。如果在獲取的細胞中有較多紅細胞，則應用紅細胞裂解液進行處理）→培養(yǎng)體系（含84 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基、15 mL FBS、1 mL 雙抗）。

1.2.2 細胞的培養(yǎng)接種到T25 瓶中（含DMEM高糖培養(yǎng)基）→隔天換液→細胞鋪滿→消化細胞→新培養(yǎng)瓶→貼壁→改用F12 誘導培養(yǎng)基（含84 mL DMEM/F12、15 mL FBS、1 mL 雙抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3 及0、10×10-5mol/L 的β-巰基乙醇）→放置37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境→隔天換液→鏡下觀察細胞有變圓→更換為1640 促成熟培養(yǎng)基（含84 mL RPMI 1640、15 mFBS、1 mL雙抗、10 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3 及0、10×10-5mol/L 的β-巰基乙醇）→7 d 換液→直至細胞誘導成熟。

1.2.3 肥大細胞功能學鑒定誘導成熟的重懸細胞液→載玻片→干燥→甲苯胺藍染色→95%C2H5OH 脫色→清洗→鏡下觀察。

1.2.4 肥大細胞形態(tài)學鑒定通過光鏡下觀察不同培養(yǎng)時間的細胞形態(tài)，直至誘導成熟。

消化細胞→洗2 次（PBS）→細胞密度1×107個/mL→每管100 μL→單染管各加入5.0 μL 的 CD117-PE 抗體及FcεR1α-FITC 抗體→雙染管加兩種抗體→空白對照管（無抗體）→避光孵育30 min→每管加1 mL PBS→離心10 min（400 g）→去上清→上法洗滌1 次→去上清→每管加100 μL PBS→檢測。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察肥大細胞生長形態(tài)

2 d 后開始出現(xiàn)以形態(tài)為長梭形的貼壁細胞；7 d 時：細胞基本將培養(yǎng)瓶鋪滿；2 周時：細胞逐漸變形；4 周時：細胞基本變?yōu)閳A形，懸浮細胞變多；6 周時：細胞基本變?yōu)轭悎A形，且形態(tài)均勻具有折光性（圖1）。

圖1 肥大細胞變形過程（100×）Fig.1 Changes in mast cells（100×）

2.2 肥大細胞的甲苯胺藍染色

培養(yǎng)6 周細胞成熟后利用甲苯胺藍染色：可以觀察到細胞質(zhì)為紫紅色，細胞核為藍色。異染顆粒的細胞加入β-巰基乙醇比不加入β-巰基乙醇的能得到更多（圖2）。

圖2 甲苯胺藍染色（100×）Fig.2 Toluene blue staining（100×）

2.3 流式細胞術(shù)檢測肥大細胞

培養(yǎng)6 周收集細胞，利用流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD117 及FcεR1α 的表達情況，加入β-巰基乙醇雙陽性細胞的比例達96.2%，大于不加入β-巰基乙醇的（圖3），且與不加β-巰基乙醇相比有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 不同濃度β-巰基乙醇誘導后CD117+FcεRIα+肥大細胞的比例Tab.1 The proportion of CD117+FcεRIα+mast cells induced by different concentrations of βmercaptoethanol

圖3 流式細胞儀檢測細胞的雙陽性率Fig.3 Double positive rate of cells detected by flow cytometry

3 討論

在正常人的心臟、主動脈及脂肪組織中有少量的MCs 存在，當人類發(fā)生疾病時MCs 的數(shù)量就會增多，比如AS。近年來，研究表明MCs 在AS的發(fā)生、發(fā)展及斑塊穩(wěn)定性中有著重要作用[9]。

當下有研究認為MCs 是利用其表面的趨化因子受體-3 與AS 斑塊中表達的嗜酸細胞活化CC趨化因子亞族中趨化因子配體-11 結(jié)合而向病變部位聚集[10]。MCs 起源于骨髓造血干細胞[11]，促進MCs 成熟的分子主要有SCF 和神經(jīng)生長因子（nerve growthfactor，NGF）[17]，SCF 可能在MCs 向受累區(qū)域聚集發(fā)揮作用，而MCs 侵入受累區(qū)域可能會進一步導致更多的炎性細胞浸潤，促進AS斑塊形成。

IL-3 又被叫做肥大細胞生長因子，在MCs 的生長、分化、遷移和效應中具有重要作用?；罨疶 細胞、天然殺傷（NK）細胞和MCs 都可產(chǎn)生IL-3，且對于SCF 在MCs 前體的發(fā)生、發(fā)展、擴增具有促進意義[12-13]。SCF 的配體CD117（c-kit）除在其表面外，各種造血祖細胞中均可存在。MCs發(fā)揮重要表面標志的是FcεRIα，但FcεRIα還表達于嗜酸性粒細胞等細胞表面，只有MCs 同時表達CD117 和FcεRIα[14]。甲苯胺藍染色是一種常用于識別及判斷MCs 功能狀態(tài)的方法，同時也是MCs 的特異性染色，可染細胞核為藍色，胞質(zhì)內(nèi)為異染性紫紅色顆粒，說明其具有吞噬功能[15]。通過甲苯胺藍染色和流式細胞儀檢測結(jié)果對誘導獲得的MCs 的純度進行鑒定，就目前來說，利用兔的骨髓間質(zhì)干細胞來誘導培養(yǎng)MCs 的報道是極少的。

本研究選用2 周齡的乳兔來獲取骨髓間質(zhì)干細胞，因為當兔齡大于或者小于2 周齡時，筆者發(fā)現(xiàn)細胞生長速度變得緩慢，可能是2 周齡的骨髓間質(zhì)干細胞的活性更好，更有利于細胞的培養(yǎng)。當IL-3 濃度10 ng/mL、SCF 濃度為10 ng/mL，加入β-巰基乙醇時：甲苯胺藍染色及流式檢測均較不加入β-巰基乙醇時可以獲取更多、雙陽性率更高的MSc，原因可能為β-巰基乙醇作為一種還原劑，在降低氧對細胞產(chǎn)生氧化損傷的同時促進干細胞生長。所以該培養(yǎng)體系是一種良好的體外誘導培養(yǎng)體系，其操作簡單，且能獲得更加成熟、更具有典型特征的MCs，為下一步對兔行進炎性損傷研究提供了優(yōu)勢。綜上所述，本研究利用形態(tài)學、功能學2 個方面對誘導的兔骨髓來源MCs 進行鑒定，培養(yǎng)出的細胞不僅具有成熟MCs 的生物學特性，還具有其功能，這便為后續(xù)的基礎研究及臨床研究奠定基礎。