賀育蘭,廖婷,謝巍偉 （湖南省婁底中心醫(yī)院,湖南 婁底 417000）

人類輔助生殖技術(shù)（ART）是指目前通過各種醫(yī)療輔助手段幫助不孕不育夫婦實(shí)現(xiàn)生育的醫(yī)療技術(shù)，主要包括人工授精、體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）、植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（PGD）等多種衍生技術(shù)。目前全球范圍內(nèi)不育夫婦中約有20%如果不接受ART則無法生兒育女，而在我國已婚夫婦中，約有10%存在生育障礙[1]。在IVF-ET中可移植卵裂期胚胎和囊胚，相較于前者，后者的著床能力更佳，且若在囊胚階段進(jìn)行移植，由于囊胚體積較大，也可一定程度上降低異位妊娠風(fēng)險(xiǎn)[2]。為了提高患者的妊娠率，IVF-ET中常移植2枚胚胎，但往往造成較高的多胎妊娠率。多胎妊娠常導(dǎo)致早產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育、雙胎輸血綜合征等較嚴(yán)重的產(chǎn)科結(jié)局。如何既能降低多胎妊娠發(fā)生率，又能提高胚胎種植率，促進(jìn)成功妊娠成了目前臨床研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)。本研究主要觀察凍胚復(fù)蘇周期中移植不同類型胚胎的患者妊娠結(jié)局，具體研究情況如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月-2021年12月期間于我院行冷凍胚胎復(fù)蘇移植（FET）的患者資料作為研究樣本進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡小于40歲；②實(shí)施ART前各項(xiàng)性激素水平均在正?？刂品秶?；③符合FET指征且自愿實(shí)施凍胚復(fù)蘇移植；④胚胎均予以玻璃化冷凍及復(fù)蘇技術(shù)實(shí)施凍融，解凍移植的胚胎為雙優(yōu)卵裂胚、雙囊胚或單囊胚，解凍后胚胎完好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在多囊卵巢綜合征等相關(guān)疾病者；②伴有子宮結(jié)構(gòu)、宮內(nèi)情況異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 方法

1.2.1 胚胎冷凍 取卵周期中胚胎培養(yǎng)至第3天或第5、6天時(shí)將移植后剩余胚胎或未移植患者的所有胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍并超低溫保存。冷凍方法：①冷凍液選擇KITAZATO玻璃化冷凍試劑盒；②在室溫下將培養(yǎng)液中的胚胎直接轉(zhuǎn)移至ES液中維持5-9min后即轉(zhuǎn)移進(jìn)VS液，并維持0.5-1min，于載桿前端滴上帶有少許VS液的胚胎并將載桿迅速浸入液氮后裝入套管，放在鋁架后將套筒封閉，最后放入液氮罐相應(yīng)位置冷凍、保存胚胎。

1.2.2 FET前子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備 ①既往月經(jīng)周期規(guī)則有排卵者可采用自然周期監(jiān)測卵泡發(fā)育，超聲監(jiān)測卵泡至排卵，于血LH峰后4天或排卵后3天行卵裂期胚胎解凍移植；于LH峰后6天或排卵后5天行囊胚解凍移植。②月經(jīng)周期不規(guī)律、排卵障礙、自然周期或促排周期內(nèi)膜薄者采用人工周期方式：月經(jīng)周期第2-3天開始口服雌二醇，用藥12天以上，根據(jù)內(nèi)膜情況和E2結(jié)果酌情調(diào)整雌激素用量；當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8mm、E2≥100pg/ml時(shí)，開始黃體酮注射液40mg/d肌注1次/天；應(yīng)用黃體酮3天后解凍卵裂期胚胎行移植術(shù)；應(yīng)用黃體酮5天后解凍囊胚行移植術(shù)。③根據(jù)患者的病情還可酌情選擇GnRH-a+人工周期及促排卵周期。如移植前子宮內(nèi)膜厚度＜7mm，或?qū)m腔內(nèi)有異?；芈暼鐚m腔積液等，則取消本周期，下周期酌情更改方案。

1.2.3 胚胎解凍及移植 ①解凍液選擇KITAZATO玻璃化解凍試劑盒；②取出液氮罐中套管內(nèi)的載桿，將載桿前端置入37℃復(fù)溫的TS液中，經(jīng)顯微鏡觀察載桿脫落后在37℃恒溫下停留1min，并將胚胎轉(zhuǎn)移至DS液于室溫下停留3min；將胚胎轉(zhuǎn)移至清洗液（WS1）停留5min后轉(zhuǎn)移至WS2液，同樣停留5min后將胚胎送入凍融胚胎培養(yǎng)皿中進(jìn)行反復(fù)沖洗，沖洗前確認(rèn)培養(yǎng)皿中可見胚胎的移植部分，隨后將沖洗后的胚胎直接轉(zhuǎn)移至已平衡好的囊胚培養(yǎng)基-1029-血清蛋白（SAGE ART-1029-SPS）培養(yǎng)液中，進(jìn)行2h培養(yǎng)后觀察胚胎解凍的情況，卵裂期胚胎在解凍后有≥50%的細(xì)胞存活則判斷為胚胎存活，囊胚解凍后2h內(nèi)復(fù)張可判定為囊胚存活[7]，解凍后所有細(xì)胞均存活判斷為胚胎完好，即可在37℃下完成胚胎移植。移植后常規(guī)進(jìn)行黃體支持。

1.2.4 輔助孵化 胚胎在復(fù)蘇后，在與卵裂球或囊胚相隔較遠(yuǎn)的透明帶處或碎片較多的地方用激光鏡頭進(jìn)行減薄，范圍約1/4-1/3透明帶。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 卵裂胚評(píng)估 D3優(yōu)質(zhì)胚胎的判定：2PN來源7-9細(xì)胞、碎片率≤10%、均勻或輕微不均勻的無多核、空泡的卵裂胚或桑椹胚。

1.3.2 囊胚評(píng)估 可移植囊胚：胚胎培養(yǎng)第5-6天時(shí)為3期及以上、滋養(yǎng)細(xì)胞以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分不同時(shí)含C級(jí)的囊胚[5]；優(yōu)質(zhì)囊胚：胚胎培養(yǎng)第5-6天時(shí)為雙原核（2PN）來源的3期及以上、滋養(yǎng)細(xì)胞及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分不含C級(jí)的囊胚。

1.3.3 妊娠結(jié)局 FET術(shù)后12-14天查尿HCG并測定血清β-HCG水平（HCG陽性：移植后12-14天血β-HCG值≥10mg/ml）；HCG陽性者，移植后26-28天超聲檢查孕囊、胚芽、心血管搏動(dòng)確定臨床妊娠及胎數(shù)。統(tǒng)計(jì)三組HCG陽性率、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料均采用(±s)表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料均采用[n(%)]表示，行卡方χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)表明組間數(shù)據(jù)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者基本情況 雙優(yōu)卵裂胚組、雙囊胚組、單囊胚組移植時(shí)女方平均年齡分別為：（31.82±4.04）歲、（31.11±4.07）歲、（32.46±4.04）歲，其中單囊胚組患者平均年齡高于雙囊胚組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組間年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

對(duì)三組臨床結(jié)局進(jìn)行比較：雙囊胚組HCG陽性率、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎妊娠率均高于雙優(yōu)卵裂胚組（P＜0.05），異位妊娠率低于雙優(yōu)卵裂胚組（P＜0.05）；單囊胚組臨床妊娠率與雙優(yōu)卵裂胚組相比無明顯差異（P＞0.05），但單囊胚組胚胎種植率明顯高于雙優(yōu)卵裂胚組（P＜0.05）、與雙囊胚組無明顯差異（P＞0.05）；單囊胚組多胎妊娠率、異位妊娠率均明顯低于雙優(yōu)卵裂胚組和雙囊胚組（P＜0.05）；三組流產(chǎn)率無明顯差異（P＞0.05）。詳見表1。

表1 三組患者臨床結(jié)局比較

2.2 單囊胚復(fù)蘇移植情況 單優(yōu)囊胚組和單非優(yōu)囊胚組進(jìn)行HCG陽性率、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率的比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 單優(yōu)囊胚與單非優(yōu)囊胚移植患者妊娠結(jié)局比較

3 討論

囊胚期是胚胎的重要發(fā)育階段，囊胚的基因調(diào)控可實(shí)現(xiàn)從母型調(diào)節(jié)到胚胎型調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)變，只有染色體正常、且質(zhì)量較好的胚胎可發(fā)育至囊胚期。臨床上多數(shù)存在生育困難的女性年齡偏大，子宮內(nèi)膜功能相對(duì)較為薄弱，囊胚移植還可一定程度上提高與女性子宮內(nèi)膜的相容性[3]。本研究中雙囊胚組臨床妊娠率、胚胎種植率均高于雙優(yōu)卵裂胚組的結(jié)果亦印證了這一觀點(diǎn)。但雙囊胚移植的實(shí)施造成了比較夸張的多胎妊娠發(fā)生率（40.40%）。多胎妊娠被認(rèn)為是ART的并發(fā)癥之一，也是一種高危妊娠，能增加早產(chǎn)、妊娠高血壓疾病、產(chǎn)后出血、新生兒窒息等情況的發(fā)生率，對(duì)胎兒娩出后的生存質(zhì)量也有著不良影響[4]。使用輔助生殖技術(shù)受孕是雙胎并發(fā)癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。如何在保證妊娠率的同時(shí)降低多胎率是輔助生殖技術(shù)實(shí)施機(jī)構(gòu)需要重點(diǎn)解決的問題。本研究結(jié)果顯示，單囊胚組獲得了與雙優(yōu)卵裂胚組相似的臨床妊娠率以及極低的多胎妊娠率，雙優(yōu)卵裂胚組多胎妊娠率雖然低于雙囊胚組，但仍然高達(dá)20.81%。本研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)單優(yōu)囊胚組與單非優(yōu)囊胚組的臨床妊娠率、胚胎種植率、異位妊娠率、流產(chǎn)率等進(jìn)行比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不過不能排除與樣本量較小、囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)主觀性較強(qiáng)等原因有關(guān)。李寧[6]等人認(rèn)為優(yōu)質(zhì)囊胚為胚胎凍融移植中的首選，即便無優(yōu)質(zhì)囊胚，單囊胚移植也應(yīng)當(dāng)作為降低多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)的首選方案。選擇性地進(jìn)行單囊胚移植是提高累計(jì)妊娠率、降低多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。相比鮮胚而言，凍胚具有更加顯著的臨床優(yōu)勢(shì)。Roy[7]等人在其相關(guān)研究中表示，囊胚凍融后移植與自然妊娠過程接近，正常胚胎一般會(huì)在發(fā)育至囊胚期后才進(jìn)入女性宮腔，將囊胚凍融后植入子宮與正常胚胎發(fā)育過程基本同步，因而囊胚移植后異位妊娠率低于卵裂胚移植可能與此相關(guān)，也與本研究結(jié)果一致。Shapiro[8]等人也認(rèn)為單囊胚移植能夠降低多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)，更好地保障母嬰安全，同時(shí)獲得了較好的臨床妊娠率。

對(duì)于單囊胚移植，新鮮胚胎移植的新生兒并發(fā)癥如低體重兒、胎兒生長受限，以及前置胎盤等發(fā)生率高于凍胚復(fù)蘇移植[9]，因此不難理解為什么越來越多的ART技術(shù)實(shí)施過程中選擇全胚冷凍的策略。近年來，隨著玻璃化冷凍技術(shù)的不斷發(fā)展與推廣，囊胚復(fù)蘇、成活率水平較高，為單囊胚移植奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。劉衛(wèi)衛(wèi)[10]等人在其相關(guān)研究中表示，對(duì)于胚胎反復(fù)種植失敗的患者來說，凍胚復(fù)蘇周期下選擇單囊胚移植或可改善其助孕結(jié)局。

總之，ART實(shí)施的首選目標(biāo)在于抱嬰回家，在促進(jìn)妊娠的同時(shí)最大可能地保障母嬰安全。凍胚復(fù)蘇周期中，雙囊胚移植可以帶來較高的臨床妊娠率，但與此同時(shí)多胎妊娠率急劇升高，隨之而來的產(chǎn)科風(fēng)險(xiǎn)也必然明顯增大；單囊胚移植（優(yōu)質(zhì)以及非優(yōu)質(zhì)單囊胚）在獲得滿意的臨床妊娠率的基礎(chǔ)上還能最大程度減少多胎妊娠率、明顯降低異位妊娠發(fā)生率，降低了產(chǎn)婦、胎兒及出生嬰兒風(fēng)險(xiǎn)；凍胚復(fù)蘇周期中選擇單囊胚移植是最為安全有效的策略。