齊 丹，田路明，董星光，張 瑩，霍宏亮，徐家玉，劉 超，張小雙，詹俊宇，張思?jí)?，曹玉?/p>

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100）

梨屬植物以二倍體為主，但是多倍體種質(zhì)也普遍存在，五大栽培梨系統(tǒng)中均有多倍體材料，如秋子梨系統(tǒng)的安梨、新疆梨系統(tǒng)的紅那禾、白梨系統(tǒng)的海棠酥、砂梨系統(tǒng)的大葉雪、西洋梨系統(tǒng)的Cure等；梨野生種的原生種中沒有發(fā)現(xiàn)多倍體，但是在次生種中的杏葉梨、木梨上發(fā)現(xiàn)了多倍體[1]。梨多倍體種質(zhì)資源是進(jìn)行梨種質(zhì)創(chuàng)新的重要材料來(lái)源，近年來(lái)梨多倍體育種收獲頗豐，如56-5-20 與喬瑪雜交育成的三倍體品種龍園洋紅[2]，大鴨梨與雪花雜交選育的三倍體品種華幸[3]，翠冠芽變選育的四倍體品種眾翠[4]，沙01 與南果梨雜交育成的三倍體品種華香酥[5]和華香脆[6]。

植物多倍體的鑒定方法包括形態(tài)初選法[7]、細(xì)胞學(xué)方法（包括染色體計(jì)數(shù)[1]和細(xì)胞核DNA 含量測(cè)定[8]）、分子標(biāo)記方法[9]。目前，梨種質(zhì)資源倍性鑒定常用的方法為細(xì)胞學(xué)方法，流式細(xì)胞術(shù)在梨倍性鑒定和基因組大小估測(cè)上均有應(yīng)用[10]，同時(shí)SSR 分子標(biāo)記根據(jù)位點(diǎn)的等位基因數(shù)可作為倍性鑒定的依據(jù)[11]。本課題組在構(gòu)建梨種質(zhì)資源指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分梨種質(zhì)資源在至少1 個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因，部分材料在報(bào)道的文獻(xiàn)中為二倍體，故與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合對(duì)梨種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定，增加倍性鑒定的準(zhǔn)確度，以期發(fā)掘新的梨多倍體材料，為梨種質(zhì)資源創(chuàng)新和遺傳改良提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為保存于國(guó)家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃的100 份梨種質(zhì)資源（表1），采集嫩葉進(jìn)行SSR熒光分子標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析。

表1 供試?yán)娣N質(zhì)資源

1.2 試驗(yàn)方法

采用CTAB 法提取梨基因組DNA，SSR 熒光標(biāo)記引物選用本實(shí)驗(yàn)室篩選的17 對(duì)高多態(tài)性引物（表2），引物擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳參照張小雙[12]的方法。用Attune NxT 流式細(xì)胞儀（Life Technologies 公司，美國(guó)）對(duì)梨種質(zhì)的嫩葉進(jìn)行染色體倍性檢測(cè)[8]。

表2 供試高多態(tài)性引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 分子標(biāo)記結(jié)果

使用17 對(duì)SSR 熒光引物對(duì)供試的100 份梨種質(zhì)資源進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，ABI3730xl 遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳結(jié)果顯示，100 份梨種質(zhì)在至少1 個(gè)SSR 位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因，其中41 份種質(zhì)在1 個(gè)SSR 位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因，11 份種質(zhì)在2 個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因，5 份種質(zhì)在3 個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因，43 份種質(zhì)在4 個(gè)及以上位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因（表3）。其中多摩1 個(gè)SSR 位點(diǎn)的3 個(gè)等位基因的電泳結(jié)果見圖1。

圖1 多摩3 個(gè)等位基因的毛細(xì)管電泳圖

表3 供試?yán)娣N質(zhì)資源擴(kuò)增3 個(gè)等位基因的位點(diǎn)數(shù)及倍性評(píng)價(jià)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)（表3），軟兒、白皮洋、豬頭、武威豬頭、Cure、珍妮阿、黑酸梨、華香酥、華香脆、杏葉梨、敦煌香水梨、路易斯、玉璧林達(dá)、昆切克、沙疙瘩、大水核、盧卡斯、安古列姆、龍園洋紅、紅那禾、大葉雪、八月雪、皮胎果、海棠酥、安梨25 份梨種質(zhì)是三倍體，甜酸、火把、棉梨、延邊磨盤、面梨、紅八里香、官紅宵、武威香蕉、青皮鐘、蜜香、長(zhǎng)把酥、其力阿木提、騷梨、六月鮮、窩窩15 份梨種質(zhì)是二倍體，沙01 是二、四倍體嵌合體或混倍體[1-2,5-6,8,10,13-18]。

用已知的二倍體棉梨作為對(duì)照，流式細(xì)胞儀測(cè)得染色體熒光強(qiáng)度值在50～55 區(qū)間出現(xiàn)較高的單峰。三倍體熒光強(qiáng)度值是二倍體的1.5 倍，在75～85 區(qū)間出現(xiàn)較高的單峰。依此判斷，帕頓、武威麥梨、墨梨、多摩、秋洋、Tralezitsa、西洋梨×花楸、廣河沙蛋梨、Summer stambol、隴西麻心、白果梨、保65-1、Dr Gyuiot、Beure Hardenpont、樂都軟兒1號(hào)、Eldorado、臨夏香把17 份種質(zhì)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)后，其倍性為三倍體，Harbo 種質(zhì)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)為二、三倍體嵌合體，這18 份種質(zhì)在以往的文獻(xiàn)中未見報(bào)道，為新鑒定出的梨多倍體種質(zhì)。其力阿木提、騷梨、六月鮮、窩窩在已報(bào)道的文獻(xiàn)中為二倍體，但在本研究中其擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因的SSR 位點(diǎn)較多，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，這4 份種質(zhì)為三倍體（表3）。部分樣品的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 9 份梨種質(zhì)資源葉片細(xì)胞的染色體熒光強(qiáng)度分布

SSR 熒光標(biāo)記結(jié)果結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在供試的100 份梨種質(zhì)資源中鑒定出多倍體種質(zhì)資源48 份（表3）。在1 個(gè)SSR 位點(diǎn)上擴(kuò)增出3個(gè)等位基因的41 份種質(zhì)均為二倍體；在2 個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因的11 份種質(zhì)，鑒定出4 個(gè)三倍體和1 個(gè)二、三倍體嵌合體；在3 個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因的5 份種質(zhì)，鑒定出3 個(gè)三倍體和1 個(gè)二、四倍體嵌合體；在4 個(gè)及以上位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因的43 份種質(zhì)，鑒定出39 個(gè)三倍體，只有Abate Fetel、紅酥梅、貴妃、沂源1 號(hào)4份種質(zhì)為二倍體。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，在17 個(gè)SSR 位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因的100 份梨種質(zhì)資源共發(fā)現(xiàn)多倍體種質(zhì)資源48 份，其中已報(bào)道的三倍體梨種質(zhì)資源25 份，二、四倍體嵌合體1 份，新鑒定出的三倍體梨種質(zhì)資源17 份，二、三倍體嵌合體1 份，與已報(bào)道的倍性研究不一致的三倍體梨種質(zhì)資源4 份，分別是其力阿木提[1]、騷梨[13]、六月鮮[15]、窩窩[1]。前人研究是使用去壁低滲法制備染色體標(biāo)本，直接對(duì)染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，本研究中這4 份種質(zhì)在指紋圖譜中顯示多個(gè)SSR 位點(diǎn)有3 個(gè)等位基因擴(kuò)增，懷疑其為三倍體，再結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定，理論上倍性鑒定結(jié)果應(yīng)該是一致的，可見有必要對(duì)4 份存在爭(zhēng)議的種質(zhì)進(jìn)行深入研究。在使用3 個(gè)及以上SSR 位點(diǎn)上擴(kuò)增出3 個(gè)等位基因的48 份種質(zhì)中，共計(jì)檢測(cè)到43 份梨多倍體種質(zhì)?？梢婋S著擴(kuò)增3 個(gè)等位基因的SSR 位點(diǎn)的增加，鑒定出的三倍體的數(shù)量也隨之增加，單一的SSR 位點(diǎn)不能準(zhǔn)確鑒定梨倍性，電泳結(jié)果多出的雜峰可能與儀器的毛細(xì)管污染有關(guān)，多個(gè)SSR 位點(diǎn)可提高鑒定的準(zhǔn)確性。將SSR熒光標(biāo)記技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合可準(zhǔn)確鑒定梨種質(zhì)資源的倍性，同時(shí)也對(duì)梨SSR 指紋圖譜的雜峰進(jìn)行剔除，提高了梨指紋圖譜的準(zhǔn)確度。

自然條件下多倍體植株的產(chǎn)生過(guò)程相對(duì)緩慢且較為罕見[19]。近年來(lái)，梨多倍體種質(zhì)的人工選育收獲頗豐，梨屬植物的三倍體來(lái)自四倍體和二倍體的雜交[20]，四倍體與二倍體雜交可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制種，且從三倍體產(chǎn)生效率來(lái)看，2n 雌配子更有優(yōu)勢(shì)[21]。如近年育成的三倍體梨品種華幸、華香酥和華香脆，均采用四倍體種質(zhì)作母本、二倍體種質(zhì)作父本。梨屬植物的四倍體通常來(lái)自芽變，有二倍體品種經(jīng)芽變選育出四倍體品種，如翠冠的四倍體芽變品種眾翠，鴨梨的四倍體芽變品種大鴨梨，也有利用秋水仙素離體誘變西洋梨品種產(chǎn)生的同源四倍體[22]。

培育多倍體植物會(huì)帶來(lái)一些好處，會(huì)增加果實(shí)大小和增強(qiáng)植株抗性，但同時(shí)三倍體植物產(chǎn)生的不育花粉比率很高，育性較低，可能對(duì)果實(shí)生產(chǎn)或育種造成問題，特別是在育種者不了解其倍性的情況下[23-24]。對(duì)梨種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定是梨種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)工作之一，本研究對(duì)保存在國(guó)家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃的梨種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定，發(fā)掘出多份梨多倍體種質(zhì)資源，補(bǔ)充和完善了梨種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)，可為梨育種工作者提供育種指導(dǎo)。