高立超 綜述 龔方戚 審校

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，浙江杭州 310052）

血小板是源自巨核細(xì)胞系的無核細(xì)胞，長期以來一直被認(rèn)為僅負(fù)責(zé)凝血和纖溶過程。然而，最近數(shù)據(jù)表明血小板也是炎癥反應(yīng)中的效應(yīng)細(xì)胞，是免疫應(yīng)答的重要組成部分［1］。血小板儲存和釋放多種生物活性物質(zhì)，如生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子等，影響免疫系統(tǒng)的各個組成部分，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。當(dāng)感染或創(chuàng)傷后，血小板與活化的內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致血小板活化［2］，該過程導(dǎo)致血小板的形狀從光滑的橢圓形變?yōu)槎啻痰那蛐危?］，功能也隨之發(fā)生變化，開始分泌各種生物活性物質(zhì)，最終演化為不可逆的活化狀態(tài)?；罨难“鍟c各類白細(xì)胞相互作用，觸發(fā)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致血栓形成和炎癥介質(zhì)的大量合成［4］。在多種血栓性疾病和炎癥性疾病中發(fā)現(xiàn)血液中血小板-白細(xì)胞聚集體（platelet leukocyte aggregates，PLAs）水平升高［5-6］。血液循環(huán)或局部炎癥部位的PLAs 被認(rèn)為可能是多種血栓、炎癥性疾病的標(biāo)志物，可用于評估血栓形成風(fēng)險和疾病進(jìn)展情況［7］。PLAs 在心血管疾病中同樣具有重要意義［8］，已有研究表明川崎病（Kawasaki disease，KD）患者中PLAs 水平顯著升高。該文綜述了最新文獻(xiàn)，探討血小板-白細(xì)胞聚集體形成機(jī)制、作用、檢測方法及其在KD 發(fā)病中的相關(guān)作用，為KD 發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。

1 PLAs的形成

血小板活化是PLAs 形成的先決條件，血小板-白細(xì)胞的初始結(jié)合由血小板P-選擇素（又稱CD62P） 和白細(xì)胞P-選擇素糖蛋白配體1 （Pselectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1） 介導(dǎo)（圖1）［9］。CD62P是一種黏附分子，血小板是其主要來源，CD62P最初位于血小板α顆粒膜上，當(dāng)血小板活化后CD62P 在血小板質(zhì)膜上表達(dá)，隨后CD62P通過PSGL-1交聯(lián)血小板和白細(xì)胞，而PSGL-1在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表面表達(dá)［10］。除了與PSGL-1 結(jié)合，CD62P 還能與S 位點受體激酶（S-locus receptor kinase，SRK）家族的酪氨酸激酶、磷脂酰肌醇3激酶、肌動蛋白和細(xì)胞骨架蛋白分子級聯(lián)激活白細(xì)胞，最終誘導(dǎo)β2 整合素巨噬細(xì)胞分化抗原-1（macrophage-1 antigen，Mac-1）的活化［11］。Mac-1則進(jìn)一步與血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰbα（GP Ⅰbα）、血小板GP Ⅱb/Ⅲa相互作用［12］，后者介導(dǎo)白細(xì)胞和血小板之間的相互作用［13］。當(dāng)血小板活化后，白細(xì)胞分化抗原40 配體（cluster of differentiation 40 ligand，CD40L）轉(zhuǎn)移到血小板表面，與內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞上白細(xì)胞分化抗原40（cluster of differentiation 40，CD40）作用，從而促進(jìn)血小板與白細(xì)胞的相互作用［14］。

2 PLAs的作用

血小板和白細(xì)胞的直接相互作用可導(dǎo)致可溶性介質(zhì)的靶向釋放和血小板-白細(xì)胞的相互激活［15］。PLAs在血栓形成中起重要作用［16］，其可能通過增加組織因子表達(dá)導(dǎo)致纖維蛋白沉積［17］。血小板-白細(xì)胞相互作用促進(jìn)白細(xì)胞募集和外滲至炎癥部位［18］，促進(jìn)白細(xì)胞釋放促炎介質(zhì)、活性氧爆發(fā)、吞噬作用、釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）［19-21］，同時還可以在某些病理條件下抑制炎癥［1，22］。在動脈粥樣硬化中，血小板與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的相互作用促進(jìn)白細(xì)胞外滲和泡沫細(xì)胞形成，從而加速了動脈粥樣硬化的形成。白細(xì)胞反過來也可調(diào)節(jié)血小板，導(dǎo)致血小板破壞增強(qiáng)或產(chǎn)生增加［23-24］。

PLAs可誘導(dǎo)多種促炎因子表達(dá)增加［25-26］，如單核細(xì)胞趨化蛋白1、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8、IL-12、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1β、干擾素α 等。然而，PLAs 還具有負(fù)反饋機(jī)制，抑制局部炎癥［27］。血小板與單核細(xì)胞的相互作用會推動單核細(xì)胞向抗炎表型發(fā)展，降低促炎因子IL-1β、IL-12 和IL-6 水平，提高IL-10 水平［28］。而血小板與中性粒細(xì)胞的相互作用也可導(dǎo)致抗炎作用，PLAs促進(jìn)脂氧素A4的產(chǎn)生，從而下調(diào)中性粒細(xì)胞的黏附和外滲［29］。

3 PLAs的分類

不同的白細(xì)胞亞群可以與血小板相互作用形成PLAs，從而產(chǎn)生各種作用［30］。由于血小板CD62P 對不同類型白細(xì)胞PSGL-1 的親和力不同［31］，血小板優(yōu)先結(jié)合單核細(xì)胞，而與淋巴細(xì)胞的親和力最低。

3.1 血小板-中性粒細(xì)胞聚集體

中性粒細(xì)胞上的PSGL-1 或Mac-1 與血小板CD62P的結(jié)合會引發(fā)中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮遷移，通過CD40 與血小板衍生的可溶性CD40L 結(jié)合形成血小板- 中性粒細(xì)胞聚集體（platelet neutrophil aggregates，PNAs），是血管內(nèi)遷移的先決條件［26］。血小板進(jìn)一步參與NET 的形成，Toll 樣受體4激活的血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合，黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上，啟動了NET 形成［32］，導(dǎo)致釋放中性粒細(xì)胞DNA，從而誘捕細(xì)菌。此外，PNAs 會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞脫顆粒和釋放IL-1β、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9），還能促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中髓過氧化物酶的形成［29］，但Cleary 等［33］發(fā)現(xiàn)小鼠吸入脂多糖后，阻斷PSGL-1、CD62P 或耗盡血液中性粒細(xì)胞并不能影響肺部血小板的募集。

3.2 血小板-單核細(xì)胞聚集體

循環(huán)單核細(xì)胞根據(jù)其CD14 和CD16 表達(dá)可分為3 個亞組：（1）經(jīng)典單核細(xì)胞（CD14++CD16-），高表達(dá)與吞噬作用相關(guān)的基因并產(chǎn)生活性氧；（2）非經(jīng)典單核細(xì)胞（CD14+CD16++），在血管巡邏和監(jiān)視中發(fā)揮作用并參與自身免疫性疾病；（3）中間單核細(xì)胞（CD14++CD16+），不僅釋放促炎的IL-1β 和TNF-α，也和抗炎因子IL-10 的產(chǎn)生有關(guān)［34］。血小板優(yōu)先與CD16+單核細(xì)胞結(jié)合，可能誘導(dǎo)經(jīng)典單核細(xì)胞向中間單核細(xì)胞轉(zhuǎn)換，Hottz 等［35］發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒感染的危重患者中血小板-單核細(xì)胞聚集體（platelet monocyte aggregates，PMAs）形成增加，同時確定了高CD16 和低人類白細(xì)胞DR 抗原表達(dá)的炎性單核細(xì)胞亞組與血小板相互作用。

3.3 其他PLAs

血小板和淋巴細(xì)胞相互作用的報道相對較少。血小板-淋巴細(xì)胞相互作用參與T 細(xì)胞表型極化，如輔助性T細(xì)胞1［4］和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞［36］。CD62P和淋巴細(xì)胞PSGL-1 結(jié)合可導(dǎo)致CD11a 聚集，通過與細(xì)胞間黏附分子1結(jié)合增強(qiáng)白細(xì)胞黏附，支持淋巴細(xì)胞向外周淋巴結(jié)高內(nèi)皮小靜脈的歸巢［29］。CD40與CD40L 相互作用是血小板誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)，CD40在成熟B細(xì)胞、部分輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞上表達(dá)［37］。通過CD40L，血小板可以直接誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體并介導(dǎo)生發(fā)中心的形成。

血小板與樹突狀細(xì)胞通過CD62P/PSGL-1 及隨后的Mac-1相互聚集，啟動單核細(xì)胞的交叉呈遞和樹突狀細(xì)胞分化［38］。和血小板與其他白細(xì)胞亞群的作用類似，血小板也可以減少樹突狀細(xì)胞的活化，如血小板能夠抑制樹突狀細(xì)胞的促炎特性，甚至可能誘導(dǎo)其抗炎表型，從而降低對T細(xì)胞的啟動能力［39］。

4 PLAs的檢測方法

目前流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡技術(shù)是檢測PLAs 的主要手段［7］。這些技術(shù)相互補充，不僅用于研究PLAs 對白細(xì)胞亞群和分子的影響，還可以明確其在組織中的位置、相互作用及功能的動態(tài)變化。

4.1 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是檢測PLAs 的首選方法，它是一種快速且靈敏的技術(shù)，可以同時分析同一樣本中的血小板活化和PLAs的形成［40］，并可對稀有白細(xì)胞亞群進(jìn)行評估。對于基本的PLAs 分析，只需要標(biāo)記血小板特異性抗體和泛白細(xì)胞特異性抗體［41］，前向散射光和側(cè)向散射光可以基本區(qū)分中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。當(dāng)需要更準(zhǔn)確地區(qū)分各白細(xì)胞亞群時，常需加入特異性抗體［7］，如CD66b（人）或Ly6G（小鼠）標(biāo)記中性粒細(xì)胞，CD14、CD16、CD64（人）或CD115、Ly6C（小鼠）標(biāo)記單核細(xì)胞，CD3、CD4、CD8（小鼠和人）標(biāo)記T 細(xì)胞，CD19（人）或CD19、B220（小鼠）標(biāo)記B 細(xì)胞，CD56（人）或NK1.1（小鼠）標(biāo)記NK細(xì)胞。

4.2 顯微鏡技術(shù)測量組織內(nèi)的靜態(tài)和動態(tài)PLAs

對冷凍或石蠟包埋的組織切片行組織化學(xué)和免疫熒光檢測可提供有關(guān)血小板募集和PLAs 在眾多組織器官微環(huán)境中的位置信息［7］。當(dāng)與共聚焦或電子顯微鏡相結(jié)合時，可提供高分辨率的圖像以定位PLAs 的位置。然而，組織切片只能提供靜態(tài)終點分析，并不能完全模擬復(fù)雜的動態(tài)行為。隨著體內(nèi)成像技術(shù)（如活體顯微鏡）的發(fā)展，現(xiàn)在可以長時間追蹤活體動物體內(nèi)不同器官中的細(xì)胞［7，42］，這有利于分析血小板和白細(xì)胞之間動態(tài)的相互作用，如持續(xù)時間和行為變化［43］。

4.3 微流控檢測

微流控檢測是另一種基于顯微鏡的實時研究血小板-白細(xì)胞相互作用的方法［44］。分離的細(xì)胞或全血通過涂有固定化蛋白質(zhì)或細(xì)胞的腔室進(jìn)行灌注，從而可以精確控制細(xì)胞輸入。類似于活體免疫熒光成像，PLAs 可以通過細(xì)胞跟蹤器或特異性抗體實現(xiàn)可視化。微流控檢測雖然不如體內(nèi)成像技術(shù)那么接近生理，但當(dāng)條件明確的情況下，它能夠低成本地實時分析血小板-白細(xì)胞的相互作用。

5 抗血小板藥物對PLAs的影響

常用的抗血小板治療包括環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）抑制劑阿司匹林和二磷酸腺苷受體P2Y12 抑制劑如氯吡格雷、普拉格雷和替格瑞洛等。阿司匹林和P2Y12 抑制劑均能減弱血小板與白細(xì)胞的相互作用，不僅影響血小板聚集和血栓形成，還能調(diào)節(jié)白細(xì)胞募集和效應(yīng)功能，使抗血小板藥物能夠作用于多種疾?。?5-46］。

5.1 阿司匹林

阿司匹林通過抑制COX-1 和COX-2 來阻止前列腺素的合成，從而抑制血小板生成血栓素A2（thromboxane A2，TxA2），而TxA2 是血小板活化的重要介質(zhì)［47］。低劑量阿司匹林可大幅減弱血小板中的COX-1 酶活性［48］，而高劑量阿司匹林通過干擾其他細(xì)胞中構(gòu)建型COX-1 和誘導(dǎo)型COX-2 的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用［49］。抑制TxA2 合成會阻斷CD40L釋放，從而減少血小板誘導(dǎo)的活性氧生成和趨化因子CXCL7 釋放，以及血小板介導(dǎo)的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化、募集、黏附和外滲［29，50］。

5.2 P2Y12抑制劑

在血小板活化過程中，P2Y12信號是其中一個重要的自分泌和旁分泌反饋回路，在血小板活化放大中具有核心作用［51］。氯吡格雷可提高內(nèi)皮一氧化氮的生物利用度并抑制血小板活化、血小板脫顆粒、PLAs 形成、炎性細(xì)胞因子和組織因子的表達(dá)，在內(nèi)毒素血癥中發(fā)揮重要作用［52］。與阿司匹林相比，氯吡格雷在減少動脈粥樣硬化性血管疾病中PLAs 的形成方面更有效［53］。有研究顯示，在接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的患者中，普拉格雷對降低二磷酸腺苷刺激的血小板-白細(xì)胞的相互作用強(qiáng)于氯吡格雷［54］。替格瑞洛是一類新型抗血小板藥物，可有效抑制血小板P2Y12 受體，并通過抑制平衡型核苷轉(zhuǎn)運體1 抑制細(xì)胞對腺苷的攝取［55］。由于替格瑞洛對血小板P2Y12 受體和平衡型核苷轉(zhuǎn)運體1的雙重抑制，替格瑞洛對炎癥的影響可能是復(fù)雜的。在肺炎患者中，替格瑞洛減少了PLAs 的形成及IL-6 的表達(dá)，接受替格瑞洛治療后，患者肺功能獲得了改善，降低了氧依賴［56］。

6 KD中PLAs的作用

KD 患兒常常表現(xiàn)為血小板增多，體內(nèi)血小板活化，表現(xiàn)出異型黏附性，可與白細(xì)胞、紅細(xì)胞聚集，多個臨床研究發(fā)現(xiàn)血小板增多、活化患者更易合并冠狀動脈損傷［57-58］。KD 中循環(huán)因子誘導(dǎo)血小板聚集和5-羥色胺釋放，導(dǎo)致血小板增多，而血小板衍生的血管活性物質(zhì)會增加血管通透性并促進(jìn)免疫復(fù)合物在組織中的進(jìn)一步沉積，其中血小板衍生微?？赡軙苯哟碳ぶ行粤＜?xì)胞、單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致組織因子的表達(dá)并增加血栓形成的風(fēng)險。使用阿司匹林后KD患者的血小板衍生微粒水平顯著下降，當(dāng)停用阿司匹林后其水平會再次上升［57］。

目前PLAs 在KD 發(fā)病中的研究較少，僅有幾個單中心臨床研究報告了PLAs 可能與KD 及其冠狀動脈損傷有關(guān)。Ueno 等［59］研究了KD 患者中PNAs 水平，發(fā)現(xiàn)KD 患兒中PNAs 水平明顯高于細(xì)菌感染患者和正常志愿者，且冠狀動脈異常患者的PNAs水平顯著高于無冠狀動脈異常者，同時發(fā)現(xiàn)與單獨使用靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治療相比，接受IVIG 聯(lián)合潑尼松龍治療的患者PNAs 顯著降低。Vignesh等［60］研究了KD患者中PMAs水平，發(fā)現(xiàn)與同年齡同性別的發(fā)熱和健康對照組相比，KD兒童隊列中PMAs 比例顯著升高。KD 中PLAs 增高的機(jī)制尚不明確，據(jù)推測當(dāng)血小板活化后其表面CD62P 表達(dá)升高，與白細(xì)胞上的PSGL-1結(jié)合導(dǎo)致PLAs的初始聚集，其后通過CD40L/CD40、Mac-1/GP Ⅰbα等相互作用，導(dǎo)致PLAs的進(jìn)一步增加。PLAs形成后介導(dǎo)TNF-α、IL-6、MMP-9等介質(zhì)的靶向釋放和白細(xì)胞-血小板的相互激活，白細(xì)胞大量遷移并在血管內(nèi)皮細(xì)胞中聚集，進(jìn)一步導(dǎo)致KD患者的冠狀動脈擴(kuò)張。已有研究表明，KD 患兒CD62P 的表達(dá)升高［58］。Arora 等［57］研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，KD患兒的可溶性CD40L水平較高。

7 抗血小板藥物在KD中的應(yīng)用

抗血小板藥物在KD治療期間占據(jù)極其重要的作用，薈萃分析表明IVIG 聯(lián)合阿司匹林能最大程度地防止KD后發(fā)生冠狀動脈異常［61］，但大劑量阿司匹林在冠狀動脈保護(hù)方面并不優(yōu)于低劑量阿司匹林［62］，甚至最近的一項大型薈萃分析發(fā)現(xiàn)急性期應(yīng)用低劑量阿司匹林的患者較大劑量阿司匹林，冠狀動脈損傷概率更低［63］。目前對中型及以上冠狀動脈瘤（Z 值≥5），建議應(yīng)用阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷等抗血小板，多項研究已證實氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林對KD合并冠狀動脈瘤患兒的抗血栓治療安全有效［64-65］。Zhang 等［66］報道了在阿司匹林基礎(chǔ)上加用氯吡格雷能更有效地降低炎癥因子IL-2受體和IL-10，并建議在血小板持續(xù)升高時應(yīng)更早加用氯吡格雷。成人中應(yīng)用氯吡格雷存在部分抵抗現(xiàn)象，北京的一項前瞻性單中心研究證實了攜帶CYP2C19功能缺失等位基因、低水平高密度脂蛋白和高水平低密度脂蛋白是我國KD患兒氯吡格雷抵抗的獨立危險因素［67］。

8 小結(jié)

近來研究表明，血小板不僅在止血、血栓形成中起作用，其在炎癥和免疫應(yīng)答中也發(fā)揮了重要作用，通過與白細(xì)胞的相互作用，血小板可以重新編程免疫網(wǎng)絡(luò)，在多種疾病中調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，包括KD。已有少量研究表明KD 中存在血小板活化及PLAs的形成，但鑒于PLAs作用的復(fù)雜性，后續(xù)仍需更多的研究，以明確PLAs 在KD發(fā)病及其冠狀動脈損傷中的具體作用，這可能成為KD研究的新方向。