李應(yīng)才，黃合琤，馬文思，楊 野

（1. 云南省昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650032； 2. 昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650500）

養(yǎng)陰清肺合劑由地黃、麥冬、玄參、川貝母、牡丹皮等8味中藥組方，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺利咽等功效，用于治療陰虛肺燥、咽喉干痛、干咳少痰或痰中帶血［1］。地黃的主要化學(xué)成分包括梓醇、地黃苷D 和地黃苷A，具有降血糖和調(diào)節(jié)免疫活性作用［2-4］。玄參中主要含有哈巴苷和哈巴俄苷環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有降血壓、鎮(zhèn)痛、解痙、抗乙肝病毒、增強(qiáng)免疫等作用［5-9］。但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅載有薄層鑒別，未對各有效成分進(jìn)行含量測定［1］，尚不能全面反映藥品質(zhì)量。已有研究采用高效液相色譜法單獨(dú)測定各藥材中的相關(guān)成分［10-17］?！吨兴幮滤庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中明確提出，復(fù)方制劑鼓勵(lì)建立多個(gè)含量測定指標(biāo)，并規(guī)定含量范圍［18］。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC - MS/ MS）法同時(shí)具備超快速液相色譜分離和高靈敏度質(zhì)譜檢測功能，能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物快速、準(zhǔn)確定性定量研究［19-23］。本研究中建立了同時(shí)測定養(yǎng)陰清肺合劑中地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷3 種活性成分含量的UPLC - MS/MS 法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

5500+QTRAP型質(zhì)譜儀（AB SCIEX 公司）；LC-40型超快速液相色譜儀（日本島津公司）；AL104型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為萬分之一）；Arium comfortⅡ型超純水儀（Sartorius 公司）；SONOREXRK 255 型超聲波清洗器（德國Bandelin公司，功率為250 W，頻率為33 kHz）。

1.2 試藥

地黃苷D 對照品（批號112063 - 202103，純度94.2%），哈巴苷對照品（批號111729 - 201707，純度96.8%），哈巴俄苷對照品（批號111730-202110，純度96.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（Thermo Fisher 公司，色譜純）；養(yǎng)陰清肺合劑（廣州白云山潘高壽藥業(yè)股份有限公司，批號分別為2203008，2111029A，2203003）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：含0.1%甲酸溶液的5 mmoL/L乙酸銨（A）- 甲醇（B），梯度洗脫（0～1.00 min 時(shí)95%A，2.00～5.00 min 時(shí)5%A，5.10～6.00 min 時(shí)95%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：550 ℃；監(jiān)測模式：正負(fù)離子模式；離子源電壓：4.5 kV；噴霧氣（Gas1）：50 Psi；輔助加熱氣（Gas2）：50 Psi；氣簾氣：20 Psi；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for each component

2.2 溶液制備

對照品溶液：取地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷對照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷質(zhì)量濃度分別為117.75，120.03，106.45 μg/ mL 的對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液各適量，置同一10 mL容量瓶中，加40%甲醇定容，搖勻，即得黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷質(zhì)量濃度分別為1.177 5，1.200 3，1.064 5 μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品0.20 mL，置50 mL容量瓶中，加40%甲醇適量，超聲處理（功率為250 W，頻率為33 kHz）30 min，放冷，加40% 甲醇定容，搖勻，0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方［1］，取除地黃外的其他7 味藥材作為陰性樣品1，取除玄參外的其他7 味藥材作為陰性樣品2，分別加水煎煮2 h，放冷，濾過，加水定容至500 mL，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件分別進(jìn)樣測定，采用MRM 模式對目標(biāo)離子進(jìn)行監(jiān)測，能有效排除基質(zhì)干擾。供試品溶液和對照品溶液色譜中，各成分峰保留時(shí)間一致，峰形良好，且雜質(zhì)及陰性樣品對檢測無干擾。色譜圖見圖1。

a. 地黃苷D b. 哈巴苷 c. 哈巴俄苷A1，A2. 陰性對照品溶液（分別缺地黃、玄參） B. 對照品溶液 C. 供試品溶液圖1 MRM色譜圖a.Rehmanin D b.Harpagoside c.HarpagosA1，A2.Negative reference solution（lacking Rehmanniae Radix and Scrophulariae Radix，respectively） B.Reference solution C.Test solutionFig.1 MRM chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液適量，用40% 甲醇逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度的對照品混合溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件測定，以各成分質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、定量離子對峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of each component（n=6）

定量限與檢測限確定：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液，用40%甲醇逐級稀釋，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件測定。分別以信噪比（S/N）為10 和3 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限和檢測限。結(jié)果地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷的定量限分別為2.32，1.00，0.06 ng/ mL，檢測限分別為0.70，0.30，0.02 ng/mL。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷質(zhì)量濃度分別為235.45，240.61，212.92 ng/mL的混合對照品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次。結(jié)果地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.61%，1.01%，1.22%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為2203008），依法制備供試品溶液，在室溫下分別于0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定。結(jié)果地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為1.86%，0.47%，2.15%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為2203008）6 份，每份0.20 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，計(jì)算待測成分的含量。結(jié)果地黃苷D、哈巴苷、哈巴俄苷含量的RSD分別為1.30%，0.62%，0.97%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號為2203008）9份，每份0.20 mL，精密加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品（批號分別為2203008，2111029A，2203003），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取樣0.20 mL，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定2 次，代入回歸方程計(jì)算待測成分的含量。結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果（μg/mL，n=2）Tab.4 Results of the content determination of each component in samples（μg/mL，n=2）

3 討論

3.1 流動相優(yōu)化

本研究中采用正負(fù)離子模式掃描，故優(yōu)化了流動相，選擇含0.1%甲酸溶液的5 mmoL/L 乙酸銨作為水相，甲醇作為有機(jī)相，梯度洗脫分離，分離效果良好。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

負(fù)離子模式下，哈巴苷主要形成m/z363.2［M-H］-準(zhǔn)分子離子，哈巴俄苷主要形成m/z493.3［M - H］-準(zhǔn)分子離子；正離子模式下，哈巴苷主要形成m/z387.2［M + Na］+準(zhǔn)分子離子，哈巴俄苷主要形成m/z517.2［M + Na］+準(zhǔn)分子離子。哈巴苷負(fù)離子模式下的響應(yīng)值更高，哈巴俄苷正離子模式下的響應(yīng)值更高，地黃苷D 正離子模式下能形成穩(wěn)定的離子。綜合考慮，選擇正負(fù)離子掃描模式。

3.3 提取溶劑、超聲提取時(shí)間選擇

比較不同體積分?jǐn)?shù)甲醇（10%，20%，30%，40%，50%，60%，80%，100%）對提取效果的影響，甲醇為提取溶劑時(shí)，地黃苷D 出現(xiàn)雙峰，考慮為純甲醇造成的溶劑效應(yīng)；甲醇體積分?jǐn)?shù)低于30%時(shí)，哈巴俄苷易形成肩峰；甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，各化合物峰形較好，響應(yīng)較高。故選擇40%甲醇作為提取溶劑。比較不同超聲提取時(shí)間（15，20，30，40，60 min）對提取效果的影響，超聲處理20 min 時(shí)，待測成分不能提取完全；超聲30，40，60 min時(shí)，待測成分的含量差異較小。故選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

3.4 樣品含量測定

玄參中哈巴苷含量是評價(jià)藥品的重要指標(biāo)。對同一廠家不同批號的3批次樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果哈巴苷的含量差異較大（33.6～90.2 μg/mL），可能是由于工藝原因或藥材質(zhì)量問題導(dǎo)致哈巴苷的含量差異，需進(jìn)一步研究。

3.5 方法評價(jià)

本研究中建立的方法靈敏度高、重復(fù)性好、分析時(shí)間短、取樣量小，可為養(yǎng)陰清肺合劑的質(zhì)量控制提供參考。