佘育純,路 勇,王建龍

(國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院急診科,陜西 西安 710119)

急診有機(jī)磷中毒是指有機(jī)磷農(nóng)藥短時(shí)大量進(jìn)入人體后造成一系列損害的中毒性急危重癥,病情進(jìn)展迅速,患者短時(shí)間內(nèi)可出現(xiàn)膽堿能神經(jīng)興奮或危象,多表現(xiàn)為嘔吐、多汗、流涎、呼吸急促、心跳減慢、瞳孔縮小等癥狀[1]。有機(jī)磷農(nóng)藥被人體吸收后迅速分布于全身各器官,引起廣泛毒性損害,對呼吸、循環(huán)、消化及神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷,腎損傷是急診有機(jī)磷中毒的常見并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)腎功能急劇下降,且預(yù)后較差,是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一,因此早期診斷、積極治療腎損傷,對改善患者預(yù)后、提高生存率具有重要意義[2-3]。有文獻(xiàn)指出,微小核糖核酸(microRNA,miR)參與多種中毒后病理損傷及修復(fù)過程,其中miR-214在急診有機(jī)磷中毒中表達(dá)異常[4]。急診有機(jī)磷中毒不僅會(huì)引起機(jī)體多臟器功能損害,還伴隨免疫功能減退,影響腎功能的恢復(fù),而T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)最重要的細(xì)胞群,對免疫應(yīng)答起調(diào)節(jié)作用[5]。炎癥反應(yīng)在多種急危重癥中起重要作用,有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入機(jī)體后通過激活免疫活性細(xì)胞進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng),分泌大量的炎癥介質(zhì),研究顯示,促炎-抗炎平衡失調(diào)是急診有機(jī)磷中毒導(dǎo)致器官損害的病理機(jī)制之一,患者腎功能減退后對毒素的清除能力下降,加重組織損傷,C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)可作為中毒程度和組織損傷程度的參考指標(biāo),廣泛應(yīng)用于急性中毒領(lǐng)域,白細(xì)胞介素-18(Interleukin 18,IL-18)是一個(gè)重要的多效能促炎因子,是導(dǎo)致機(jī)體損傷的重要炎性介質(zhì)[6-7]。目前關(guān)于急診有機(jī)磷中毒患者miR-214、T淋巴細(xì)胞、炎癥因子水平變化及其與腎損傷關(guān)系的報(bào)道甚少,尚未有公認(rèn)能反映急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的靈敏指標(biāo),基于此,本研究旨在分析急診有機(jī)磷中毒患者外周血miR-214、T淋巴細(xì)胞和炎癥因子的表達(dá)與早期腎損傷的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2022年1月在我院進(jìn)行診治的80例急診有機(jī)磷中毒患者為研究對象,將其作為研究組,根據(jù)是否發(fā)生早期腎損傷將其分為腎損傷組(n=24)和非腎損傷組(n=56),另選取同期50例健康體檢者作為對照組。研究組中男44例,女36例;年齡22～68歲,平均(43.40±13.68)歲;體重指數(shù)18～27 kg/m2,平均(22.17±1.58)kg/m2。對照組中男28例,女22例;年齡20～65歲,平均(42.91±13.39)歲;體重指數(shù)18～25 kg/m2,平均(21.16±1.62)kg/m2。兩組一般資料經(jīng)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),組間可進(jìn)行比較。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①研究組患者符合《急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒診治臨床專家共識(2016)》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn);②無認(rèn)知功能障礙者;③未進(jìn)行血液灌流治療者;④未使用過影響免疫功能的藥物者;⑤無慢性腎臟病史者;⑥資料齊全、數(shù)據(jù)完整者。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有感染性疾病者;②合并有惡性腫瘤者;③合并有嚴(yán)重心、肺、腦疾病者;④近期服用過腎毒性藥物者;⑤進(jìn)行過器官移植者;⑥合并有泌尿系統(tǒng)疾病者。

1.2 研究方法

1.2.1 收集研究對象一般資料:包括性別、年齡、體重指數(shù)、中毒時(shí)間、服毒量、miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平。入院后采集晨起空腹外周血3 ml,按照3000 r/min的速度離心5 min,分離上層血清,置于-20 ℃環(huán)境下保存待檢。

1.2.2 miR-214檢測方法:采用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA,待標(biāo)本鑒定合格后,行反轉(zhuǎn)錄,試劑盒由日本TOYOBO公司、大連TaKaRa公司提供。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測外周血miR-214水平,PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性2 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35個(gè)循環(huán)。miR-214莖環(huán)引物:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-ACTGCCT-3’,上游引物:5’-TTTGTTGACAGCAG-GCACAGAC-3’,下游引物:5’-TCCAGTGCAGGG-TCCGAGGT-3’,由上海Sangon Biotech公司合成,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-214的相對表達(dá)量。

1.2.3 T淋巴細(xì)胞檢測方法:采用ESPIL-XL流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN公司)檢測T淋巴細(xì)胞亞群,包括CD3+、CD8+水平。

1.2.4 炎癥因子檢測方法:采用CX7型全自動(dòng)生化分析儀(美國BECKMAN公司)檢測CRP、IL-18水平,試劑盒由法國Diaclone公司提供。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較對照組、研究組miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平。②單因素分析。比較腎損傷組、非腎損傷組性別、年齡、體重指數(shù)、中毒時(shí)間、服毒量、miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平。③多因素Logistic回歸分析。采用多因素Logistic回歸分析急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的危險(xiǎn)因素。④受試者工作特征曲線(ROC)分析。采用ROC曲線分析miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平對急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的預(yù)測價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平比較 研究組miR-214、CRP、IL-18水平均高于對照組,CD3+、CD8+水平均低于對照組(均P<0.05),見表1。

表1 兩組miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平比較

2.2 急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示,腎損傷組miR-214、CRP、IL-18水平均高于非腎損傷組,CD3+、CD8+水平均低于非腎損傷組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);而兩組間性別、年齡、體重指數(shù)、中毒時(shí)間、服毒量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表2。

表2 急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的單因素分析

2.3 影響急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的變量賦值 將表2中存在差異的因素進(jìn)行變量賦值,結(jié)果見表3。

表3 影響急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的變量賦值

2.4 急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平均為影響急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的危險(xiǎn)因素(OR=5.094、5.726、5.441、5.479、6.080,均P<0.05),見表4。

表4 急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的多因素Logistic回歸分析

2.5 ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平在預(yù)測急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷中具有較高價(jià)值(均P<0.05),見表5。

表5 ROC曲線分析

3 討 論

有機(jī)磷中毒是急診常見病癥之一,是我國發(fā)生率最高的中毒類型,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國每年發(fā)病人數(shù)約為5萬～6萬,具有發(fā)病快、病情重、病死率高等特點(diǎn),常因救治不當(dāng)危及患者生命安全。有機(jī)磷農(nóng)藥經(jīng)由皮膚或消化道等途徑進(jìn)入人體后,與乙酰膽堿酯酶相結(jié)合致使乙酰膽堿無法正常分解,進(jìn)而引起乙酰膽堿異常聚集,引發(fā)廣泛毒性損害[9]。

除結(jié)合乙酰膽堿酯酶導(dǎo)致中毒這一機(jī)制外,有機(jī)磷農(nóng)藥分子還可通過干擾細(xì)胞能量代謝、抑制免疫系統(tǒng)功能、損傷DNA等多種機(jī)制引發(fā)全身系統(tǒng)性損害。miR廣泛參與疾病的損傷與修復(fù)過程,其在巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖分化過程中起著重要作用,參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究證實(shí),有機(jī)磷農(nóng)藥分子進(jìn)入機(jī)體后會(huì)引發(fā)miR異常表達(dá),miR-214可通過靶向調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá),發(fā)揮介導(dǎo)并干擾正常的核酸合成與代謝、神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能,在物質(zhì)與能量代謝、細(xì)胞活化與增殖、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮功能紊亂、氧化應(yīng)激、免疫與炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮調(diào)控作用,高表達(dá)的miR-214可能經(jīng)由上述調(diào)控途徑參與急診有機(jī)磷中毒的發(fā)生及中毒后多器官功能損害等病理過程,進(jìn)而影響患者預(yù)后[10-11]。有機(jī)磷中毒導(dǎo)致各臟器出現(xiàn)一系列病理生理變化后,還會(huì)導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能減退。T淋巴細(xì)胞保證機(jī)體免疫功能得以正常維持,當(dāng)T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生數(shù)量變化時(shí),其功能也發(fā)生異常,導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂,進(jìn)一步加重病理損害[12]。發(fā)生急診有機(jī)磷中毒后,患者CD3+、CD8+百分比下降表明成熟T細(xì)胞總數(shù)減少,使得T細(xì)胞免疫儲(chǔ)備量減少,導(dǎo)致無法充分接觸抗原發(fā)生免疫應(yīng)答[13]。免疫學(xué)機(jī)制表明,外源性毒素進(jìn)入人體后,除對機(jī)體組織細(xì)胞產(chǎn)生直接破壞作用外,還會(huì)引發(fā)自身免疫反應(yīng)、激活炎性細(xì)胞,當(dāng)炎性細(xì)胞被過度激活進(jìn)而釋放過量的致炎因子時(shí),將會(huì)引發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征,造成組織器官損傷,進(jìn)一步引發(fā)多器官功能障礙綜合征,這被諸多學(xué)者認(rèn)為是有機(jī)磷中毒致死的主要原因[14]。研究表明,當(dāng)人體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí),血液中CRP濃度迅速升高,參與炎癥反應(yīng);IL-18可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等產(chǎn)生干擾素-γ,刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α,調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞表達(dá),促發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥性損傷[15]。本研究結(jié)果顯示,研究組miR-214、CRP、IL-18水平均高于對照組,CD3+、CD8+水平均低于對照組,提示miR-214、CRP、IL-18在急診有機(jī)磷中毒患者中呈高表達(dá),CD3+、CD8+呈低表達(dá),可作為早期判斷急診有機(jī)磷中毒的標(biāo)志物。

急診有機(jī)磷中毒可引發(fā)機(jī)體多系統(tǒng)損傷,其中消化、呼吸、心血管方面的損傷是臨床關(guān)注的重點(diǎn),但關(guān)于腎損傷的研究較少。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),有機(jī)磷中毒是腎損傷發(fā)生的主要誘因之一,有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入機(jī)體后迅速遍布全身,可直接作用于腎小球和腎小管,還可通過自由基損傷導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死,同時(shí),患者中毒后會(huì)破壞腎臟毛細(xì)血管壁,體內(nèi)多種血管活性物質(zhì)異常釋放,血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變,導(dǎo)致腎低血壓灌注,腎小球?yàn)V過率急劇下降,引起腎小管缺血性壞死,故早期識別腎損傷對有機(jī)磷中毒的搶救具有重要意義[16-17]。本研究結(jié)果顯示,腎損傷組miR-214、CRP、IL-18水平均高于非腎損傷組,CD3+、CD8+水平均低于非腎損傷組;多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平均為影響急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷的危險(xiǎn)因素;ROC曲線分析顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18在預(yù)測急診有機(jī)磷中毒患者發(fā)生早期腎損傷中具有較高價(jià)值,提示急診有機(jī)磷中毒會(huì)引發(fā)腎損傷,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平可以預(yù)測腎損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對其中原因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),王寧等[18]在缺血性急性腎損傷大鼠腎組織中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-214,其水平高達(dá)健康大鼠腎組織中的8倍,且隨著水平升高會(huì)導(dǎo)致腎小管細(xì)胞凋亡加重,采用miR-214抑制劑后腎小管細(xì)胞凋亡可得到相應(yīng)緩解。腎損傷發(fā)生后腎組織的修復(fù)和再生依賴促炎、抗炎細(xì)胞群的相互平衡作用,因此,腎功能恢復(fù)與T淋巴細(xì)胞的功能狀態(tài)密切相關(guān),T淋巴細(xì)胞的新生與凋亡在正常人體中處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),以維持正常的免疫功能,但患病后該平衡可能被打破,導(dǎo)致了機(jī)體免疫功能低下,對內(nèi)毒素等抗原的處理能力減弱,加速病情進(jìn)展,增加感染發(fā)生概率,導(dǎo)致多臟器功能衰竭[19]。腎間質(zhì)纖維化導(dǎo)致腎小球上皮細(xì)胞在缺氧損傷過程中釋放出大量炎癥趨化因子,造成機(jī)體炎癥狀態(tài),CRP水平在機(jī)體發(fā)生急性損傷時(shí)快速上升,能夠較為敏感地反映組織損傷程度,IL-18是作用最強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化因子之一,其可通過增加炎癥因子表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生不同種類的活性物質(zhì),是導(dǎo)致機(jī)體損傷的重要炎性遞質(zhì),CRP、IL-18水平上升意味著腎損傷病情進(jìn)展[20]。

綜上所述,急診有機(jī)磷中毒患者miR-214、CRP、IL-18表達(dá)量升高、CD3+、CD8+表達(dá)量降低有助于疾病的早期判斷,在預(yù)測早期腎損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中具有較高的臨床價(jià)值,為臨床治療提供了參考,早期應(yīng)注意毒物的清除,同時(shí)也應(yīng)注意免疫功能的調(diào)節(jié)與改善,以提高患者的治愈率。但本研究納入樣本量較小,結(jié)果可能無法全面反映臨床真實(shí)情況,尚需開展大規(guī)模、多中心的研究來證實(shí)該結(jié)論。