呂瑜玫,陳 丹,朱 橋,王 丹

(解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川 成都 610083)

宮頸癌(Cervical cancer,CC)是指在致癌因子和高危因素的作用下宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞發(fā)生異常增生的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤疾病[1]。在發(fā)展中國(guó)家最為常見(jiàn),呈現(xiàn)正常上皮、癌前病變、早期浸潤(rùn)癌、浸潤(rùn)癌的病變過(guò)程,早期無(wú)明顯癥狀,大多發(fā)現(xiàn)時(shí)病已處于晚期浸潤(rùn)階段,對(duì)患者的生命健康造成極大威脅[2]。據(jù)報(bào)道[3-4],我國(guó)CC患者5年的生存率Ⅰ期為82%～90%,Ⅱ-Ⅲ期則降至50%～75%,晚期僅為20%～33%,可見(jiàn)其生存率隨著病情惡化而不斷下降。故早日診斷和治療CC患者對(duì)于提高生存率至關(guān)重要。有研究表明[5],CC的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因表達(dá)水平的失調(diào)有關(guān)。而隨著微小核糖核酸(microribonucleic acid,miRNA)的發(fā)現(xiàn)為CC的診斷提供了新的標(biāo)志物,miRNA為長(zhǎng)21～23個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA,能夠負(fù)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達(dá),其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。miRNA-381、miRNA-145是近來(lái)研究較多的miRNA,且在不同的病理特征中具有不同的意義,但目前多用于乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌等的臨床研究,關(guān)于其與CC的文獻(xiàn)較少[8-9]?；诖?本研究選擇2018年12月至2022年12月本院收治的CC患者作為研究對(duì)象,旨在探究miR-381、miRNA-145表達(dá)水平的變化及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,以期為臨床判斷病情進(jìn)展和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本院2018年12月至2022年12月收治的80例宮頸癌患者(觀察組)和同期68例健康女性體檢者(對(duì)照組)納為研究對(duì)象。觀察組年齡32～70歲,平均(58.69±7.59)歲;初潮年齡10～18歲,平均(14.26±1.52)歲;體重指數(shù)18～24 kg/m2,平均(20.56±1.79)kg/m2;懷孕次數(shù)0～1次56例,≥2次24例;遺傳史有6例,無(wú)74例;乳頭瘤病毒感染陽(yáng)性56例,陰性24例;腫瘤直徑<4 cm 32例,≥4 cm 48例;病理類(lèi)型鱗癌50例,腺癌30例;病理分期Ⅰ-Ⅱ期46例,Ⅲ-Ⅳ期34例;組織分化程度低分化19例,中分化38例,高分化23例;浸潤(rùn)深度≤1/2肌層31例,>1/2肌層49例;脈管浸潤(rùn)陽(yáng)性67例,陰性13例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性29例,陰性51例。對(duì)照組年齡30～68歲,平均(57.59±7.61)歲;初潮年齡12～20歲,平均(15.12±1.46)歲;體重指數(shù)18～23 kg/m2,平均(21.42±1.66)kg/m2;懷孕次數(shù)0～1次48例,≥2次20例;遺傳史是4例,否64例。兩組在年齡、初潮年齡、體重指數(shù)、懷孕次數(shù)、癌癥遺傳史等方面比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),具有可比性。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①以病理性檢測(cè)結(jié)果為診斷、分組依據(jù);②符合《宮頸癌診治指南解讀》[10]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、臨床分期等;③年齡18～75歲,意識(shí)清楚可配合評(píng)估;④入組前未接受手術(shù)、放化療、免疫治療等;⑤臨床診療完整,生命體征平穩(wěn);⑥患者對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在其他惡性腫瘤疾病或惡性腫瘤史;②存在凝血功能異常、感染疾病、心腎功能不全、精神疾病等;③存在盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜炎等疾病。倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)本研究。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集:所有患者均于入組時(shí)未經(jīng)任何處理前進(jìn)行采集。于清晨空腹采集靜脈血3 ml,置于促凝管后4 ℃下行1500 r/min離心處理15 min,取上層血清于-80 ℃下保存待測(cè)。

1.2.2 血清總RNA提取:應(yīng)用北京天根生化科技公司生產(chǎn)的miRcute miRNA試劑盒提取總RNA,嚴(yán)格遵說(shuō)明書(shū)操作。將冷凍血清樣本解凍后取200 μl置于內(nèi)套管中,加入1 ml裂解液震蕩搖勻,室溫下靜置5 min待核酸蛋白復(fù)合物分離后加入200 μl氯仿混勻,靜置5 min,而后4 ℃行12000 r/min離心處理15 min,取上層無(wú)色水相和2倍體積的無(wú)水乙醇混勻置于內(nèi)套管靜置10 min,經(jīng)2次漂洗液洗脫和4次高速離心交叉后將新液移入新的RNeasy-Free離心管中,加入15 μl RNase-free ddH2O,室溫下靜注2 min,12000 r/min離心處理2 min得總RNA。取2 μl總RNA應(yīng)用微量分光光度儀檢測(cè)RNA(260/280 nm)吸光度,值為1.8～2.0。

1.2.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄:應(yīng)用北京天根生化科技公司生產(chǎn)的miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(加A法)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,嚴(yán)格遵說(shuō)明書(shū)操作。解凍2×miRNA反轉(zhuǎn)錄緩沖液并混勻,miRNA反轉(zhuǎn)錄混合酶置于冰盒上備用,于預(yù)冷RNase Free反應(yīng)管中加入10 μl緩沖液、2 μl混合酶、2 μl總RNA和RNase-free ddH2O至總體積20 μl。將上述配制反應(yīng)物混勻后,42 ℃進(jìn)行miRNA的加A尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),時(shí)間為60 min,再于95 ℃下進(jìn)行酶失活反應(yīng)3 min得第一鏈cDNA。

1.2.4 miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平檢測(cè):應(yīng)用北京天根生化科技公司生產(chǎn)的SYBR Green FP250熒光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清miRNA-381、miRNA-145相對(duì)表達(dá)水平,嚴(yán)格遵說(shuō)明書(shū)操作。20 μl反應(yīng)體系為:10 μl 2×miRNA定量預(yù)混試劑、2 μl cDNA、正反向引物各0.6 μl和ddH2O補(bǔ)足,混勻后置于PCR儀上擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃、15min;變性94 ℃、20 s;退火60 ℃、34 s;40 s個(gè)循環(huán),反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)設(shè)定閾值所循環(huán)次數(shù)為Ct值,ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因U6。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-381、miRNA-145相對(duì)表達(dá)水平。應(yīng)用上海生工生物有限公司合成的引物,序列如下:通用反向引物5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3’;其他正向引物內(nèi)參U6為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;miRNA-381為5’-CGAGUGCCACCUCTAGG-3’;miRNA-145為5’-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3’。所有操作過(guò)程均遵守《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[11]。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩組的miRNA-381、miRNA-145水平。②采用t檢驗(yàn)或F檢驗(yàn)分析miRNA-381、miRNA-145相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平比較 觀察組血清miRNA-381、miRNA-145水平均低于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平的比較

2.2 CC血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CC血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平與患者年齡、乳頭瘤病毒感染、腫瘤直徑、病理分期等因素?zé)o關(guān)(均P>0.05);與病理類(lèi)型、組織分化程度、浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05),宮頸腺癌患者表達(dá)水平低于宮頸鱗癌,低分化、中分化、高分化患者表達(dá)水平依次升高,肌層浸潤(rùn)深度越深表達(dá)水平越高,脈管浸潤(rùn)陽(yáng)性患者的表達(dá)水平低于陰性患者,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的表達(dá)水平低于陰性患者(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CC血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

據(jù)報(bào)道[12-13],CC的發(fā)生率和病死率均占全球第4位,多是由于早期病情不顯,當(dāng)出現(xiàn)陰道不規(guī)則出血、分泌物異常、下腹或腰骶部疼痛癥狀時(shí)已發(fā)生癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移,確診后已無(wú)法治愈,總體生存時(shí)間僅為1年。故早日篩查、診斷和治療是提高患者的生存率的關(guān)鍵。病理組織活檢是診斷CC的金標(biāo)準(zhǔn),但多為侵入性操作來(lái)獲得標(biāo)本,無(wú)法成為早期篩查CC的方法,而血液標(biāo)本相對(duì)而言采集較為便利[14],因此為提高CC篩查診斷的準(zhǔn)確性,探尋高敏感度、高特異性的血清標(biāo)志物是十分必要的[15]。隨著基因?qū)W研究的進(jìn)步,miRNA在惡性腫瘤的研究中備受關(guān)注,較多學(xué)者證明了其血清異常表達(dá)水平與CC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的結(jié)論。

本研究結(jié)果顯示,觀察組血清中miRNA-381、miRNA-145水平均低于對(duì)照組。miRNA-381、miRNA-145均為腫瘤抑制miRNA,通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7(FGF7)、人類(lèi)基因細(xì)胞 Myc(c-Myc)等靶基因的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的增生、分化、遷移、侵襲等,進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,故其表達(dá)水平下降是惡性腫瘤疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素[16]。崔琴等[8]研究指出,低表達(dá)miRNA-381能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡;周琨等[17]也在研究中指出,應(yīng)用miRNA-381抑制劑后乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲活性顯著增強(qiáng),說(shuō)明miRNA-381是在腫瘤疾病中具有細(xì)胞保護(hù)作用的基因;黃剛、祝磊等[9,18]研究中miRNA-145在非小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌中均處于低表達(dá)水平,能顯著抑制癌細(xì)胞的異變過(guò)程,發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用,在肺癌、結(jié)腸癌等診斷中均具有較高的特異性和敏感性。上述研究均提示miRNA-381、miRNA-145會(huì)在惡性腫瘤疾病中呈現(xiàn)低表達(dá),故其在CC中的表達(dá)也呈現(xiàn)低水平,恰好印證了本研究結(jié)果。徐潔歡、喻長(zhǎng)法等[19-20]研究提示miRNA-381、miRNA-145參與CC的發(fā)生發(fā)展,在CC中呈現(xiàn)低表達(dá),與本研究結(jié)果相一致。

以往有關(guān)miRNA-381、miRNA-145在CC中的報(bào)道多與其表達(dá)水平對(duì)疾病診斷的價(jià)值和對(duì)疾病進(jìn)程的影響有關(guān),較少研究其對(duì)具體臨床病理參數(shù)的作用。因此本文對(duì)其在CC不同病理參數(shù)血清表達(dá)中的差異進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,CC患者血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平情況基本一致:均與患者年齡、乳頭瘤病毒感染、腫瘤直徑、病理分期等因素?zé)o關(guān),與病理類(lèi)型、組織分化程度、浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)果表明,兩個(gè)miRNA對(duì)CC不同病理特征的影響相當(dāng),提示二者可能在CC的發(fā)展、診斷和治療中發(fā)揮著相似或協(xié)同的作用。miRNA-381、miRNA-145在年齡、是否存在乳頭瘤病毒感染、腫瘤直徑、不同分期CC的血清表達(dá)中無(wú)明顯差異,提示上述miRNA的表達(dá)水平不易受患者自身情況、腫瘤自身特性等因素影響。

在與血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平相關(guān)的病理參數(shù)中,宮頸腺癌患者表達(dá)水平低于宮頸鱗癌,低分化、中分化、高分化患者表達(dá)水平依次升高,肌層浸潤(rùn)深度越深表達(dá)水平越高,脈管浸潤(rùn)陽(yáng)性患者的表達(dá)水平低于陰性患者,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的表達(dá)水平低于陰性患者。結(jié)果提示血清miRNA-381、miRNA-145表達(dá)水平在不同的病理特征中具有不同的意義,在病理類(lèi)型、組織分化程度、浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征中呈現(xiàn)鱗癌表達(dá)高于腺癌,分化程度、浸潤(rùn)深度越高表達(dá)水平越高,陰性表達(dá)高于陽(yáng)性的結(jié)果,正好印證了miRNA-381、miRNA-145在CC中呈現(xiàn)低表達(dá)的結(jié)論,同時(shí)也進(jìn)一步說(shuō)明其參與CC的進(jìn)展能顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移和侵襲,疾病惡化程度越深其表達(dá)水平越低,可根據(jù)病理參數(shù)的變化來(lái)預(yù)測(cè)患者的病情進(jìn)展,為CC患者的診療和預(yù)后情況提供參考依據(jù)。

綜上所述,血清miRNA-381、miRNA-145在CC患者中呈低表達(dá),其表達(dá)水平與CC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)水平變化可及時(shí)篩查、診斷和治療疾病,或可成為CC早期診斷新的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。