呂瑜玫,陳 丹,朱 橋,王 丹

(解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產科,四川 成都 610083)

宮頸癌(Cervical cancer,CC)是指在致癌因子和高危因素的作用下宮頸內上皮細胞發(fā)生異常增生的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤疾病[1]。在發(fā)展中國家最為常見,呈現(xiàn)正常上皮、癌前病變、早期浸潤癌、浸潤癌的病變過程,早期無明顯癥狀,大多發(fā)現(xiàn)時病已處于晚期浸潤階段,對患者的生命健康造成極大威脅[2]。據報道[3-4],我國CC患者5年的生存率Ⅰ期為82%～90%,Ⅱ-Ⅲ期則降至50%～75%,晚期僅為20%～33%,可見其生存率隨著病情惡化而不斷下降。故早日診斷和治療CC患者對于提高生存率至關重要。有研究表明[5],CC的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因表達水平的失調有關。而隨著微小核糖核酸(microribonucleic acid,miRNA)的發(fā)現(xiàn)為CC的診斷提供了新的標志物,miRNA為長21～23個核苷酸的非編碼小分子RNA,能夠負調控腫瘤相關基因表達,其異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[6-7]。miRNA-381、miRNA-145是近來研究較多的miRNA,且在不同的病理特征中具有不同的意義,但目前多用于乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌等的臨床研究,關于其與CC的文獻較少[8-9]。基于此,本研究選擇2018年12月至2022年12月本院收治的CC患者作為研究對象,旨在探究miR-381、miRNA-145表達水平的變化及與臨床病理參數(shù)的關系,以期為臨床判斷病情進展和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本院2018年12月至2022年12月收治的80例宮頸癌患者(觀察組)和同期68例健康女性體檢者(對照組)納為研究對象。觀察組年齡32～70歲,平均(58.69±7.59)歲;初潮年齡10～18歲,平均(14.26±1.52)歲;體重指數(shù)18～24 kg/m2,平均(20.56±1.79)kg/m2;懷孕次數(shù)0～1次56例,≥2次24例;遺傳史有6例,無74例;乳頭瘤病毒感染陽性56例,陰性24例;腫瘤直徑<4 cm 32例,≥4 cm 48例;病理類型鱗癌50例,腺癌30例;病理分期Ⅰ-Ⅱ期46例,Ⅲ-Ⅳ期34例;組織分化程度低分化19例,中分化38例,高分化23例;浸潤深度≤1/2肌層31例,>1/2肌層49例;脈管浸潤陽性67例,陰性13例;淋巴結轉移陽性29例,陰性51例。對照組年齡30～68歲,平均(57.59±7.61)歲;初潮年齡12～20歲,平均(15.12±1.46)歲;體重指數(shù)18～23 kg/m2,平均(21.42±1.66)kg/m2;懷孕次數(shù)0～1次48例,≥2次20例;遺傳史是4例,否64例。兩組在年齡、初潮年齡、體重指數(shù)、懷孕次數(shù)、癌癥遺傳史等方面比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05),具有可比性。病例納入標準:①以病理性檢測結果為診斷、分組依據;②符合《宮頸癌診治指南解讀》[10]中相關標準、臨床分期等;③年齡18～75歲,意識清楚可配合評估;④入組前未接受手術、放化療、免疫治療等;⑤臨床診療完整,生命體征平穩(wěn);⑥患者對本研究知情同意。排除標準:①存在其他惡性腫瘤疾病或惡性腫瘤史;②存在凝血功能異常、感染疾病、心腎功能不全、精神疾病等;③存在盆腔炎、子宮內膜異位癥、子宮內膜炎等疾病。倫理委員會已批準本研究。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集:所有患者均于入組時未經任何處理前進行采集。于清晨空腹采集靜脈血3 ml,置于促凝管后4 ℃下行1500 r/min離心處理15 min,取上層血清于-80 ℃下保存待測。

1.2.2 血清總RNA提取:應用北京天根生化科技公司生產的miRcute miRNA試劑盒提取總RNA,嚴格遵說明書操作。將冷凍血清樣本解凍后取200 μl置于內套管中,加入1 ml裂解液震蕩搖勻,室溫下靜置5 min待核酸蛋白復合物分離后加入200 μl氯仿混勻,靜置5 min,而后4 ℃行12000 r/min離心處理15 min,取上層無色水相和2倍體積的無水乙醇混勻置于內套管靜置10 min,經2次漂洗液洗脫和4次高速離心交叉后將新液移入新的RNeasy-Free離心管中,加入15 μl RNase-free ddH2O,室溫下靜注2 min,12000 r/min離心處理2 min得總RNA。取2 μl總RNA應用微量分光光度儀檢測RNA(260/280 nm)吸光度,值為1.8～2.0。

1.2.3 RNA逆轉錄:應用北京天根生化科技公司生產的miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(加A法)將總RNA逆轉錄合成cDNA,嚴格遵說明書操作。解凍2×miRNA反轉錄緩沖液并混勻,miRNA反轉錄混合酶置于冰盒上備用,于預冷RNase Free反應管中加入10 μl緩沖液、2 μl混合酶、2 μl總RNA和RNase-free ddH2O至總體積20 μl。將上述配制反應物混勻后,42 ℃進行miRNA的加A尾反應和反轉錄反應,時間為60 min,再于95 ℃下進行酶失活反應3 min得第一鏈cDNA。

1.2.4 miRNA-381、miRNA-145表達水平檢測:應用北京天根生化科技公司生產的SYBR Green FP250熒光定量檢測試劑盒檢測血清miRNA-381、miRNA-145相對表達水平,嚴格遵說明書操作。20 μl反應體系為:10 μl 2×miRNA定量預混試劑、2 μl cDNA、正反向引物各0.6 μl和ddH2O補足,混勻后置于PCR儀上擴增,反應程序為:預變性95 ℃、15min;變性94 ℃、20 s;退火60 ℃、34 s;40 s個循環(huán),反應體系中熒光信號達設定閾值所循環(huán)次數(shù)為Ct值,ΔCt=Ct目標基因-Ct內參基因U6。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-381、miRNA-145相對表達水平。應用上海生工生物有限公司合成的引物,序列如下:通用反向引物5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3’;其他正向引物內參U6為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;miRNA-381為5’-CGAGUGCCACCUCTAGG-3’;miRNA-145為5’-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3’。所有操作過程均遵守《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[11]。

1.3 觀察指標 ①比較兩組的miRNA-381、miRNA-145水平。②采用t檢驗或F檢驗分析miRNA-381、miRNA-145相對表達水平與臨床病理參數(shù)的相關性。

2 結 果

2.1 兩組血清miRNA-381、miRNA-145表達水平比較 觀察組血清miRNA-381、miRNA-145水平均低于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清miRNA-381、miRNA-145表達水平的比較

2.2 CC血清miRNA-381、miRNA-145表達水平與臨床病理參數(shù)的關系 CC血清miRNA-381、miRNA-145表達水平與患者年齡、乳頭瘤病毒感染、腫瘤直徑、病理分期等因素無關(均P>0.05);與病理類型、組織分化程度、浸潤深度、脈管浸潤、淋巴結轉移有關(均P<0.05),宮頸腺癌患者表達水平低于宮頸鱗癌,低分化、中分化、高分化患者表達水平依次升高,肌層浸潤深度越深表達水平越高,脈管浸潤陽性患者的表達水平低于陰性患者,淋巴結轉移陽性患者的表達水平低于陰性患者(均P<0.05)。見表2。

表2 CC血清miRNA-381、miRNA-145表達水平與臨床病理參數(shù)的關系

3 討 論

據報道[12-13],CC的發(fā)生率和病死率均占全球第4位,多是由于早期病情不顯,當出現(xiàn)陰道不規(guī)則出血、分泌物異常、下腹或腰骶部疼痛癥狀時已發(fā)生癌細胞浸潤、轉移,確診后已無法治愈,總體生存時間僅為1年。故早日篩查、診斷和治療是提高患者的生存率的關鍵。病理組織活檢是診斷CC的金標準,但多為侵入性操作來獲得標本,無法成為早期篩查CC的方法,而血液標本相對而言采集較為便利[14],因此為提高CC篩查診斷的準確性,探尋高敏感度、高特異性的血清標志物是十分必要的[15]。隨著基因學研究的進步,miRNA在惡性腫瘤的研究中備受關注,較多學者證明了其血清異常表達水平與CC發(fā)生、發(fā)展密切相關的結論。

本研究結果顯示,觀察組血清中miRNA-381、miRNA-145水平均低于對照組。miRNA-381、miRNA-145均為腫瘤抑制miRNA,通過抑制成纖維細胞生長因子7(FGF7)、人類基因細胞 Myc(c-Myc)等靶基因的表達來抑制癌細胞的增生、分化、遷移、侵襲等,進而促進癌細胞凋亡,故其表達水平下降是惡性腫瘤疾病發(fā)生的危險因素[16]。崔琴等[8]研究指出,低表達miRNA-381能促進胃癌細胞的增殖與凋亡;周琨等[17]也在研究中指出,應用miRNA-381抑制劑后乳腺癌細胞的遷移、侵襲活性顯著增強,說明miRNA-381是在腫瘤疾病中具有細胞保護作用的基因;黃剛、祝磊等[9,18]研究中miRNA-145在非小細胞肺癌和結腸癌中均處于低表達水平,能顯著抑制癌細胞的異變過程,發(fā)揮抑制腫瘤生長和轉移的作用,在肺癌、結腸癌等診斷中均具有較高的特異性和敏感性。上述研究均提示miRNA-381、miRNA-145會在惡性腫瘤疾病中呈現(xiàn)低表達,故其在CC中的表達也呈現(xiàn)低水平,恰好印證了本研究結果。徐潔歡、喻長法等[19-20]研究提示miRNA-381、miRNA-145參與CC的發(fā)生發(fā)展,在CC中呈現(xiàn)低表達,與本研究結果相一致。

以往有關miRNA-381、miRNA-145在CC中的報道多與其表達水平對疾病診斷的價值和對疾病進程的影響有關,較少研究其對具體臨床病理參數(shù)的作用。因此本文對其在CC不同病理參數(shù)血清表達中的差異進行了研究。結果顯示,CC患者血清miRNA-381、miRNA-145表達水平情況基本一致:均與患者年齡、乳頭瘤病毒感染、腫瘤直徑、病理分期等因素無關,與病理類型、組織分化程度、浸潤深度、脈管浸潤、淋巴結轉移有關。結果表明,兩個miRNA對CC不同病理特征的影響相當,提示二者可能在CC的發(fā)展、診斷和治療中發(fā)揮著相似或協(xié)同的作用。miRNA-381、miRNA-145在年齡、是否存在乳頭瘤病毒感染、腫瘤直徑、不同分期CC的血清表達中無明顯差異,提示上述miRNA的表達水平不易受患者自身情況、腫瘤自身特性等因素影響。

在與血清miRNA-381、miRNA-145表達水平相關的病理參數(shù)中,宮頸腺癌患者表達水平低于宮頸鱗癌,低分化、中分化、高分化患者表達水平依次升高,肌層浸潤深度越深表達水平越高,脈管浸潤陽性患者的表達水平低于陰性患者,淋巴結轉移陽性患者的表達水平低于陰性患者。結果提示血清miRNA-381、miRNA-145表達水平在不同的病理特征中具有不同的意義,在病理類型、組織分化程度、浸潤深度、脈管浸潤、淋巴結轉移等病理特征中呈現(xiàn)鱗癌表達高于腺癌,分化程度、浸潤深度越高表達水平越高,陰性表達高于陽性的結果,正好印證了miRNA-381、miRNA-145在CC中呈現(xiàn)低表達的結論,同時也進一步說明其參與CC的進展能顯著促進癌細胞的分化、轉移和侵襲,疾病惡化程度越深其表達水平越低,可根據病理參數(shù)的變化來預測患者的病情進展,為CC患者的診療和預后情況提供參考依據。

綜上所述,血清miRNA-381、miRNA-145在CC患者中呈低表達,其表達水平與CC的發(fā)生發(fā)展密切相關,通過檢測其表達水平變化可及時篩查、診斷和治療疾病,或可成為CC早期診斷新的生物標記物和治療靶點。