劉麗霞,王 釗

(大連市中醫(yī)醫(yī)院婦科, 遼寧 大連 116001)

卵巢癌是女性常見的致死性惡性腫瘤,由于疾病早期診斷困難,大多數(shù)患者被診斷為晚期,甚至發(fā)生腹膜或遠端器官轉(zhuǎn)移,給疾病治療帶來巨大困難[1-3]。近年來分子靶向治療和基因治療已成為腫瘤治療的新趨勢,研究卵巢癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機制有助于開發(fā)新的卵巢癌治療靶點。微小RNA(microRNA,miRNA)是重要的非編碼RNA,其通過在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平負調(diào)控基因表達參與許多細胞過程的調(diào)控。miRNA表達失調(diào)與腫瘤細胞的異常增殖以及惡性侵襲等生物學行為有關(guān),是癌癥進展的促進或抑制因子[4-5]。微小RNA-105-5p(microRNA-105-5p,miR-105-5p)在肝癌干細胞中表達降低,可促進肝癌干細胞生長[6]。早期研究指出卵巢癌中miR-105-5p表達下調(diào)[7],但miR-105-5p是否參與卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移仍然未知。白細胞介素6(Interleukin 6,IL-6)是卵巢癌免疫微環(huán)境中存在的免疫調(diào)節(jié)細胞因子[8]。IL-6R在卵巢癌組織、細胞中表達增加,下調(diào)IL-6R表達顯著降低卵巢癌細胞體外增殖、侵襲能力以及體內(nèi)致瘤性[9]。本研究通過生物信息學發(fā)現(xiàn)IL-6R是miR-105-5p潛在靶點,于是推測miR-105-5p可能靶向調(diào)控IL-6R參與卵巢癌進展。本研究重點分析了miR-105-5p和IL-6R在卵巢癌組織中表達水平,揭示了miR-105-5p和IL-6R表達對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響,闡明了miR-105-5p對IL-6R的靶向調(diào)控作用,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取2017—2018年在我院確診進行手術(shù)治療的30例卵巢癌組織和對應的癌旁組織標本。癌旁組織為距離腫瘤邊緣大于2 cm處正常卵巢組織。所有組織樣本切除后立即置于液氮中,后保存于-80 ℃冰箱中。病例納入標準:術(shù)后病理診斷確診為卵巢癌。排除標準:術(shù)前接受抗腫瘤治療。研究開展之前已獲得我院倫理委員會批準,且所有患者或其家屬均知情同意。

1.2 細胞和試劑 SKOV-3購于中科院上海細胞庫;miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA分析試劑盒購于美國ABI公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green Master mix購于日本takara公司;熒光素酶報告載體、miR-576-3p模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC mimics)、IL-6R小干擾RNA(si-IL-6R)及其陰性對照(si-NC)、IL-6R過表達載體(pcDNA-IL-6R)及其陰性對照(pcDNA-NC)購于廣州復能基因公司;細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購于北京索萊寶公司;Transwell和Transwell小室購于北京優(yōu)尼康公司;羊抗兔IgG二抗以及兔抗人、IL-6R、磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67(Antigen identified by monoclonal antibody,Ki-67)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)單克隆抗體購于上海艾博抗公司。

1.3 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-105-5p和IL-6R表達 TRIzol試劑提取卵巢癌組織中總RNA,純化后利用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA分析試劑盒檢測miR-105-5p表達。利用逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green Master Mix檢測IL-6R mRNA表達水平。miR-105-5p上游引物5’-UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU-3’,下游引物5’-CATCCTCGATGGTCTCCTGC-3’;U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;IL-6R上游引物5’-TCACTGTGTCATCCACGAC G-3’,下游引物5’-AGCCAGCTATCTGGGGAAGA-3’;GAPDH上游引物5’-GACCTGACCTG CCGTCTA-3’,下游引物5’-GGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。

1.4 細胞培養(yǎng)、實驗分組和細胞活力檢測 用含1%青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV-3細胞。將對數(shù)期SKOV-3細胞接種6孔板,利用Lipofectamine 2000將miR-NC mimics、miR-105-5p mimics、si-NC、si-IL-6R、miR-576-3p mimics與pcDNA-NC、miR-576-3p mimics與pcDNA-IL-6R分別轉(zhuǎn)染融合率為50%的SKOV-3細胞,分別標記為miR-NC mimics組、miR-105-5p mimics組、si-NC組、si-IL-6R組、miR-576-3p mimics+pcDNA-NC組、miR-576-3p mimics+pcDNA-IL-6R組,轉(zhuǎn)染48 h采用RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測轉(zhuǎn)染效果,合格后進行后續(xù)實驗。將轉(zhuǎn)染細胞按照3×104個/ml、0.1 ml/孔轉(zhuǎn)移至96孔板,培養(yǎng)箱孵育48 h時添加按10 μl/孔添加CCK-8溶液。再孵育2 h后,酶標儀測量450 nm的各孔光密度(OD)值。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 使用無血清細胞培養(yǎng)基將各組細胞制成3×104個/ml的細胞懸液。取200 μl細胞懸浮液加至預先涂有(侵襲)或未涂(遷移)基質(zhì)膠Transwell上腔室中,同時將下腔室中加入500 μl含10%血清的細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱孵育24 h后,除去膜上未穿膜細胞,甲醇固定膜下表面細胞后進行結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計數(shù)5個隨機視野細胞數(shù),采用其均值表示細胞遷移或侵襲細胞數(shù)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(WB)分析IL-6R、Ki-67以及MMP-2和MMP-9蛋白表達 冰上裂解各組細胞并收集上清液,二辛可寧酸法測定蛋白質(zhì)濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,并在室溫下用脫脂牛奶封閉膜2 h,再與1∶1500稀釋的抗IL-6R、Ki-67、MMP-2、MMP-9抗體在4 ℃下過夜,最后與二抗孵育2 h。增強型化學發(fā)光試劑檢測蛋白條帶,Image J軟件測定各條帶灰度值,以目的蛋白和內(nèi)參灰度值比值表示對應蛋白相對表達量。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?生物信息學軟件在線分析顯示miR-105-5p和IL-6R-3’-UTR存在互補序列。將含有miR-105-5p結(jié)合位點的IL-6R-3’UTR序列插入pGL3載體下游構(gòu)建野生型熒光素酶報告載體WT-IL-6R-3’UTR。通過突變miR-105-5p的預測結(jié)合位點,構(gòu)建野生型熒光素酶報告載體MUT-IL-6R-3’UTR。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-IL-6R-3’UTR或MUT-IL-6R-3’UTR分別與miR-105-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞,雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染48 h后熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組織中miR-105-5p和IL-6R表達情況 卵巢癌組織中miR-105-5p表達量較癌旁組織顯著降低(P<0.05),而IL-6R表達量較癌旁組織顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 卵巢癌組織中miR-105-5p和IL-6R表達情況

2.2 miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-105-5p mimics組SKOV-3細胞miR-105-5p表達量較miR-NC mimics組顯著升高(P<0.05),而細胞活力、遷移和侵襲細胞數(shù)、IL-6R、Ki-67以及MMP-2和MMP-9表達量顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 miR-105-5p靶向調(diào)控IL-6R的表達 生物信息學軟件預測miR-105-5p的靶基因發(fā)現(xiàn)miR-105-5p與IL-6R-3’UTR之間存在特異性互補序列,見圖1。WT-IL-6R-3’UTR和miR-105-5p mimics共轉(zhuǎn)染后SKOV-3細胞相對熒光素酶活性較WT-IL-6R-3’UTR和miR-NC共轉(zhuǎn)染顯著降低;而MUT-IL-6R-3’UTR和miR-105-5p mimics共轉(zhuǎn)染后SKOV-3細胞相對熒光素酶活性較MUT-IL-6R-3’UTR和miR-NC共轉(zhuǎn)染無顯著變化,見表3。

圖1 IL-6R的序列中含有與miR-105-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4 抑制IL-6R表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-IL-6R組SKOV-3細胞IL-6R表達量、細胞活力、遷移和侵襲細胞數(shù)、Ki-67以及MMP-2和MMP-9表達量較si-NC組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 抑制IL-6R表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5 過表達IL-6R可逆轉(zhuǎn)miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-576-3p mimics+pcDNA-IL-6R組SKOV-3細胞IL-6R表達量、細胞活力、遷移和侵襲細胞數(shù)、Ki-67以及MMP-2和MMP-9表達量較miR-576-3p mimics +pcDNA-NC組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 過表達IL-6R可逆轉(zhuǎn)miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

幾十年來,已經(jīng)鑒定出多種miRNA在卵巢癌發(fā)生和進展中起關(guān)鍵作用。例如miR-126-3p低表達參與卵巢癌細胞增殖和侵襲[10]。miR-148a-3p低表達卵巢癌異種移植瘤小鼠體內(nèi)腫瘤形成[11]。上調(diào)控miR-378a-3p表達可提高卵巢癌細胞的順鉑敏感性[12]。本研究檢測到卵巢癌組織中miR-105-5p表達量顯著降低,這提示miR-105-5p異常低表達可能參與卵巢癌進展。功能分析發(fā)現(xiàn),過表達miR-105-5p可抑制SKOV-3細胞增殖、遷移和侵襲,表明miR-105-5p在卵巢癌中起著抑癌作用。與本研究發(fā)現(xiàn)類似,在膠質(zhì)瘤中過表達miR-105-5p抑制膠質(zhì)瘤細胞生長、集落形成和遷移,抑制膠質(zhì)瘤進展,進一步證實miR-105-5p的抑癌作用[13]。為探討miR-105-5p的抗癌機制,本研究檢測細胞增殖相關(guān)蛋白以及遷移侵襲相關(guān)蛋白表達水平。Ki-67與細胞有絲分裂密切相關(guān),Ki-67水平越高,細胞增殖越活躍,組織分化越差[14]。在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中MMP家族蛋白具有重要功能,尤其是MMP-2、MMP-9,其可降解細胞外基質(zhì)中各種組分,其表達增加可增強癌細胞遷移和侵襲能力[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-105-5p導致Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達增加,這提示過表達miR-105-5p可通過影響增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達進而降低卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。

IL-6R在人類癌癥中表達上調(diào)并發(fā)揮致癌作用,且IL-6R表達受miRNA調(diào)控。研究報道m(xù)iR-218靶向IL-6R抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和腫瘤形成[17]。在費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病中miR-451a表達降低,其重新表達通過IL-6R抑制白血病細胞增殖、誘導細胞凋亡[18]。miR-451通過靶向IL-6R-STAT3途徑還可抑制肝癌血管生成[19]。此外,有研究指出在卵巢癌中miR-204的順鉑增敏作用亦與靶向負調(diào)控IL-6R有關(guān)[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中IL-6R表達顯著增加。進一步研究證實IL-6R是miR-105-5p的直接靶點,過表達miR-105-5p顯著降低卵巢癌細胞中IL-6R表達水平,提示miR-105-5p可能靶向IL-6R參與卵巢癌進展。通過功能缺失實驗分析IL-6R對卵巢癌細胞生物學行為影響顯示,干擾IL-6R表達顯著降低SKOV-3細胞活力以及遷移侵襲能力,并降低Ki-67以及MMP-2、MMP-9蛋白表達水平,這表明IL-6R在卵巢癌中具有致癌功能。過表達miR-105-5p和干擾IL-6R表達的抗癌作用一致,且過表達IL-6R顯著減弱miR-105-5p過表達對SKOV-3細胞增殖、遷移以及相關(guān)蛋白表達的影響,恢復SKOV-3細胞的增殖、遷移和侵襲能力,這進一步證實靶向負調(diào)控IL-6R是miR-105-5p抑制卵巢癌進展的重要途徑。

綜上所述,卵巢癌中miR-105-5p表達下調(diào),過表達miR-105-5p通過靶向下調(diào)IL-6R可抑制卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移,這豐富了卵巢癌進展的分子機制,為卵巢癌治療提供了潛在靶點。