王 浩,高春美

(淄博一四八醫(yī)院急診科,山東 淄博 255300)

血流感染(Bloodstream infection,BSI)指病原菌在血液循環(huán)中繁殖并釋放毒素和代謝產(chǎn)物造成的全身性炎癥反應(yīng)綜合征,可快速引起膿毒性休克(Septic shock,SS)并威脅患者生命安全,文獻(xiàn)報(bào)道每延遲6 h,生存率可下降7%以上[1-3]。血液透析(Hemodialysis,HD)是治療急慢性腎功能衰竭常用手段,有利于快速清除體內(nèi)蓄積的代謝產(chǎn)物并進(jìn)行物質(zhì)交換,從而達(dá)到維持電解質(zhì)和酸堿平衡的作用[4]。導(dǎo)管相關(guān)性感染(Catheter related bloodstream infection,CRBSI)是HD治療常見并發(fā)癥,羅杏英等[5]報(bào)道顯示發(fā)病率達(dá)11.45%,是影響患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素,因此明確CRBSI發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)機(jī)制具有重要臨床意義。近年來(lái)對(duì)炎癥信號(hào)通路在膿毒癥中作用的認(rèn)識(shí)已逐漸明確,病變?cè)缙谂c促炎因子引起的“炎癥風(fēng)暴”密切相關(guān),病變晚期則表現(xiàn)為抗炎因子可大量表達(dá)并造成免疫抑制,為疾病不同階段采用合理干預(yù)方案提供參考[6]。既往研究表明Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)中最早被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行深入研究的一種,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其中TLR4接受細(xì)菌或病毒等抗原刺激后可通過(guò)髓樣分化因子88(Myeioid differentiation factor88,MyD88),依賴途徑激活下游核因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB)信號(hào)通路并參與調(diào)控白介素(Interleukin,IL)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄,從而造成炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大[7-9]。本研究主要分析外周血單核細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活與HD合并CRBSI患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2022年12月間淄博一四八醫(yī)院HD治療期間出現(xiàn)的82例CRBSI患者(CRBSI組)為樣本進(jìn)行橫斷面研究,病例納入標(biāo)準(zhǔn):①符合CRBSI相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];②均經(jīng)病原學(xué)檢查證實(shí);③接受規(guī)律HD治療且每周≥2次;④年齡≥18歲;⑤患者和家屬知曉本研究?jī)?nèi)容并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并乙肝、艾滋病病毒(HIV)及結(jié)核等傳染病或病史;②合并其他類型感染性疾病;③免疫抑制劑或激素類藥物長(zhǎng)期應(yīng)用史;④合并惡性腫瘤或放化療史;⑤合并1個(gè)月內(nèi)手術(shù)或外傷病史;⑥合并精神疾病或認(rèn)知障礙。同時(shí)另選取我院同期未發(fā)生CRBSI的HD患者83例(HD組),納入標(biāo)準(zhǔn)包括年齡≥18歲、規(guī)律HD治療且頻率為每周≥2次以及患者和家屬知情同意,排除標(biāo)準(zhǔn)全部同CRBSI組,本研究?jī)?nèi)容符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2 研究方法

1.2.1 資料采集和分析:收集三組性別、年齡、既往史、基礎(chǔ)疾病及合并癥等基本資料,測(cè)量身高、體重和血壓等指標(biāo)并計(jì)算體重指數(shù)(Body Mass Index,BMI),采用急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)評(píng)估感染嚴(yán)重程度,同時(shí)采集三組入組第1天空腹外周靜脈血5 ml×3管保存?zhèn)溆?分別檢測(cè)外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平,根據(jù)分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)將HD合并CRBSI患者分為休克組23例和非休克組59例并按指南進(jìn)行治療[11],同時(shí)隨訪28 d病死率。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞TLR4檢測(cè):將血液樣本在4 ℃環(huán)境以1500 r/min離心15 min,去除上清液后采用Coulter Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)分離單核細(xì)胞,加入2倍體積培養(yǎng)液并以6000 r/min離心5 min,將沉淀層細(xì)胞加入全培養(yǎng)液中并治愈含50% CO2的培養(yǎng)箱中溫育24 h,然后在15 ℃環(huán)境以1000 r/min離心5 min,去除上清液并加入帶PE標(biāo)記的兔抗人TLR4單克隆抗體和二抗(英國(guó)Abcam公司),避光冰浴60 min后采用NanoDrop ND-1000型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)測(cè)量TLR4熒光強(qiáng)度值,以β-actin光密度值為對(duì)照計(jì)算TLR4相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 外周血單核細(xì)胞NF-κB檢測(cè):將血液樣本5 ml與D-Hank’s液5 ml充分混勻后以1500 r/min離心15 min,吸取第1、3層之間的白色細(xì)胞并置于5 ml D-Hank’s液中,充分搖勻并以2000 r/min離心15 min,去除上清液后以PBS緩沖液洗滌2次,再采用全培養(yǎng)液重懸24 h,PBS緩沖液洗滌1次,靜置25 min后加入10% NP-40并渦動(dòng)10 s,室溫條件下以15000 r/min離心30 s后去除上清液,再與Buffer C冷緩沖液充分混勻并進(jìn)行冰浴,其間連續(xù)攪拌40 min,然后在4 ℃條件下以16000 r/min離心10 min,取上清加入NF-κB單抗和(英國(guó)Abcam公司)并測(cè)量NF-κB熒光強(qiáng)度并以β-actin光密度值為對(duì)照計(jì)算NF-κB相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 炎癥因子檢測(cè):將血液樣本5 ml在4 ℃環(huán)境以3000 r/min離心15 min并取上清-20 ℃保存,采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)IL-4、IL-6和TNF-α水平,試劑盒均有上?；瞪锛夹g(shù)有限公司生產(chǎn),所有操作步驟均嚴(yán)格遵循說(shuō)明書要求完成。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 CRBSI組APACHEⅡ評(píng)分明顯高于HD組(P<0.05),兩組性別、年齡、BMI、透析齡、煙酒史、基礎(chǔ)疾病及合并癥等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活情況比較 CRBSI組外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平高于HD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表2。

表2 兩組TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活情況比較

2.3 不同嚴(yán)重程度HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活情況比較 休克組HB合并CRBSI患者外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平高于非休克組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表3。

表3 不同嚴(yán)重程度HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活情況比較

2.4 不同預(yù)后HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活情況比較 隨訪結(jié)果顯示CRBSI組28 d病死患者數(shù)量為17例(20.73%),病死組HB合并CRBSI患者外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平高于存活組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表4。

表4 不同預(yù)后HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活情況比較

2.5 TLR4/NF-κB信號(hào)通路與HD合并CRBSI感染嚴(yán)重程度的關(guān)系 HB合并CRBSI患者外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均與APACHEⅡ評(píng)分呈明顯正相關(guān)性(P<0.05),見表5。

表5 TLR4/NF-κB信號(hào)通路與HD合并CRBSI感染嚴(yán)重程度的關(guān)系

3 討 論

近年來(lái)由于人口老齡化、抗生素濫用和侵入性操作等因素影響,CRBSI發(fā)病率和嚴(yán)重程度明顯增加,美國(guó)學(xué)者開展的回顧性隊(duì)列研究顯示住院患者菌血癥發(fā)生率和病死率分別為5.9%和15.6%[12-13]。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)對(duì)湖北省47所醫(yī)院ICU醫(yī)院感染連續(xù)4年的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示CRBSI發(fā)病率為1.45‰[14]。雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)CRBSI重視程度明顯增加,但發(fā)病率目前仍然較高且患者預(yù)后不理想,原因可能與其詳細(xì)發(fā)病機(jī)制尚未完全明確有關(guān)。

HD患者因腎功能損害和免疫功能減退,導(dǎo)致體內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平異常并不斷蓄積,因此透析過(guò)程中常處于慢性炎癥狀態(tài),CRBSI發(fā)生率受創(chuàng)傷或雜質(zhì)等因素影響明顯升高[15]。既往研究表明CRBSI主要危險(xiǎn)因素包括年齡、營(yíng)養(yǎng)水平、血管通路以及透析時(shí)間等,感染發(fā)生后可快速進(jìn)展為膿毒癥甚至休克[16]。文獻(xiàn)報(bào)道膿毒癥為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和代償性抗炎反應(yīng)(CARS)共同作用所致,感染早期促炎反應(yīng)占明顯優(yōu)勢(shì),患者表現(xiàn)為高熱、高代謝以及休克,該過(guò)程與細(xì)菌內(nèi)毒素、肽聚糖或脂蛋白等抗原激活單核巨噬細(xì)胞或其他淋巴細(xì)胞表面TLRs/NF-κB信號(hào)通路并誘導(dǎo)大量炎癥因子表達(dá)關(guān)系密切[17-19]。TLR4為高度保守性的Ⅰ型跨膜蛋白,是目前認(rèn)識(shí)最為全面的人體PRRs,廣泛分布于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞等胞膜表面,在固有免疫和特異性免疫反應(yīng)中均占有重要地位[20]。NF-κB為Rel/NF-κB家族成員轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,正常情況下與特異性抑制蛋白(IKB)結(jié)合為無(wú)活性三聚體,在胞外信號(hào)刺激下發(fā)生磷酸化并向細(xì)胞核遷移,從而誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示與單純HD患者相比,合并CRBSI的患者外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平明顯升高,提示CRBSI發(fā)生與TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活存在密切聯(lián)系,與關(guān)亞男等[22]報(bào)道結(jié)果相一致。同時(shí)本研究結(jié)果顯示休克組和病死組患者外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平較非休克組和存活組均明顯升高,可見HD合并CRBSI患者病情嚴(yán)重程度還與TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)系密切。APACHEⅡ評(píng)分是評(píng)估重癥患者病情和預(yù)后常用方法,本研究Pearson積差系數(shù)分析顯示HD合并CRBSI患者外周血單核細(xì)胞TLR4和NF-κB表達(dá)水平與APACHEⅡ評(píng)分呈明顯正相關(guān)性,可見TLR4/NF-κB信號(hào)通路在CRBSI病情進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

炎癥反應(yīng)是膿毒癥發(fā)生和進(jìn)展關(guān)鍵環(huán)節(jié),張婭琴等[23]以98例膿毒癥患者為樣本進(jìn)行研究表明降鈣素原(PCT)和C反應(yīng)蛋白(CRP)等炎性指標(biāo)對(duì)評(píng)估病情嚴(yán)重程度和預(yù)后具有重要參考價(jià)值。本研究中CRBSI組血清IL-4、IL-6和TNF-α水平明顯高于HD組,其中IL-4為抗炎因子,IL-6和TNF-α為促炎因子,表明HD合并CRBSI感染患者體內(nèi)同時(shí)促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng),兩者平衡破壞是導(dǎo)致病情進(jìn)展和預(yù)后不良的重要機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道膿毒癥患者早期通常表現(xiàn)為過(guò)度炎癥反應(yīng),后期抗炎因子代償性表達(dá)增加可抑制促炎因子表達(dá)并導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)期處于免疫抑制階段,容易繼發(fā)其他感染并造成不良后果,因此臨床治療方案需根據(jù)疾病階段進(jìn)行合理選擇,血清IL-4、IL-6和TNF-α等炎癥因子表達(dá)水平是重要參考依據(jù)[24]。本研究中休克組和病死組HD合并CRBSI患者血清IL-4、IL-6和TNF-α表達(dá)水平明顯升高,且Pearson積差分析顯示與APACHEⅡ評(píng)分呈明顯正相關(guān)性,表明炎癥因子與病情輕重密切相關(guān)。Li等[25]報(bào)道顯示TLR4/NF-κB信號(hào)通路可刺激大量炎癥因子釋放,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集,是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要基礎(chǔ),可見TLR4/NF-κB信號(hào)通路在誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)中發(fā)揮重要作用,與HD合并CRBSI病情嚴(yán)重程度存在密切聯(lián)系。

綜上所述,TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活和炎癥因子大量表達(dá)與HD合并CRBSI患者發(fā)病和進(jìn)展存在密切聯(lián)系,對(duì)評(píng)估病情嚴(yán)重程度和合理選擇治療方案具有良好參考價(jià)值。