張海龍,牟小會,王 萍,滕 敏

貴州省安順市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,貴州安順 561000

新型冠狀病毒核酸檢測既是確診新型冠狀病毒感染病例和無癥狀感染者的實(shí)驗(yàn)室依據(jù),也是疫情處置措施判定的重要標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。有研究在各機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展新型冠狀病毒核酸檢測過程中發(fā)現(xiàn),由陽性標(biāo)本、質(zhì)控品及擴(kuò)增產(chǎn)物造成的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染、標(biāo)本污染易導(dǎo)致假陽性的檢測結(jié)果,從而造成防控措施過度、人員恐慌及對核酸檢測結(jié)果不可信等問題[3-5]。

針對因人員操作不當(dāng)、質(zhì)控品管理不到位等原因造成的陽性標(biāo)本、質(zhì)控品及擴(kuò)增產(chǎn)物污染可通過加強(qiáng)操作人員培訓(xùn)、規(guī)范質(zhì)控品管理、實(shí)施實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)評估及管理等方式來避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[6-7]。而在加樣和核酸提取過程中,因移液吸頭外壁攜帶污染以及核酸提取儀高速震蕩形成的氣溶膠污染引起的假陽性則很難避免[6,8-9]。這種情況通常發(fā)生在相鄰孔為強(qiáng)陽性標(biāo)本或質(zhì)控品時,會造成初篩結(jié)果為陽性而復(fù)檢結(jié)果為陰性,從而需要進(jìn)行復(fù)檢或重新采樣檢測[10],很大程度上增加了檢測工作量。

為快速、直觀地顯示初篩結(jié)果中可能為孔間交叉污染的孔位,便于及時復(fù)檢,同時減少不必要的第2次復(fù)檢。本研究基于“掃雷游戲”模式,根據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增原理設(shè)置判斷規(guī)則,用Excel表格模擬設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)板,直觀顯示實(shí)時檢測結(jié)果及可能存在污染的孔位,以方便后續(xù)復(fù)檢及結(jié)果判斷。

1 資料與方法

1.1一般資料 從上海宏石實(shí)時熒光定量PCR儀中導(dǎo)出2022年11月29日隔離點(diǎn)送檢的、檢測編號為027B檢測板的新型冠狀病毒核酸檢測原始數(shù)據(jù),共計(jì)90例標(biāo)本、3個陰性對照、2個空白對照及1個弱陽性對照的檢測結(jié)果。

1.2方法

1.2.1檢測規(guī)則 新型冠狀病毒核酸檢測的初篩試劑選用上海思路迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司試劑;第1次和(或)第2次復(fù)檢則采用“初篩試劑+湖南圣湘生物科技有限公司試劑”的雙試劑復(fù)檢模式。

1.2.2基于“掃雷游戲”的評估規(guī)則 12×8的核酸提取深孔板,除周邊及四角孔位的相鄰孔位較少(3～5個)外,其余孔位均可能受到周邊8個孔位的加樣攜帶污染和提取儀震蕩帶來的氣溶膠污染。因此,如果該孔位檢測結(jié)果為陽性,則可能是源于周邊8個孔位中強(qiáng)陽性標(biāo)本的污染。

1.2.3被污染孔的循環(huán)數(shù)(Ct)值-污染源孔Ct值≥5的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定 按照PCR擴(kuò)增原理,當(dāng)擴(kuò)增效率為100%時,檢測結(jié)果間相差n個Ct值即代表標(biāo)本待測模板間存在2n倍差異。為了最大限度地標(biāo)識出可能被污染的孔位,假設(shè)加樣200 μL的標(biāo)本可能導(dǎo)致相鄰孔位累計(jì)最大量6.25 μL的攜帶污染或氣溶膠污染。此時,陰性標(biāo)本可能被污染,其病毒含量約為污染源孔的1/32[6.25/(200.00-6.25)],則被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值=5。因此,為找出所有可能被相鄰孔污染的孔位,可設(shè)定“被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值≥5”的條件來識別被污染孔。

1.2.4Excel2021直觀標(biāo)識可能被污染孔位 用Excel2021模擬設(shè)計(jì)2塊PCR反應(yīng)板(孔位號按照逐列排序的方式賦號),其中1塊從原始數(shù)據(jù)中提取ORF1ab及N基因兩個靶標(biāo)的檢測值,并按照擴(kuò)增區(qū)12×8的模式對應(yīng)顯示反應(yīng)孔的Ct值(2個靶標(biāo)均無Ct值時不顯示)。另一塊板的每個單元格輸入函數(shù)“IF(AND(MIN(OFFSET(Sheet4!B3,-1,-1,3,3))<=41,MIN(OFFSET(Sheet4!B14,-1,-1,3,3))<=41,Sheet4!B3-MIN(OFFSET(Sheet4!B3,-1,-1,3,3))>5,Sheet4!B14-MIN(OFFSET(Sheet4!B14,-1,-1,3,3))>5,Sheet4!B3<=41,Sheet4!B14<=41,OR(Sheet4!B3<>41,Sheet4!B14<>41)),(ROW()-2)+(COLUMN()-16)*8&"號位可能污染","")”,調(diào)用Sheet4中各反應(yīng)孔的ORF1ab和N基因的檢測值進(jìn)行運(yùn)算:當(dāng)該孔位檢測為陽性(即ORF1ab或N基因有Ct值)時,分別用該孔的ORF1ab和N基因的Ct值減去周邊8個相鄰孔位中ORF1ab和N基因最小的Ct值,當(dāng)兩個計(jì)算結(jié)果均≥5時,標(biāo)識該孔位可能被污染。為方便計(jì)算,無Ct值的靶標(biāo)默認(rèn)其Ct值為最大擴(kuò)增Ct(41)。見圖1。

注:A用于顯示各反應(yīng)孔ORF1ab和N基因的Ct值;B用于顯示可能污染的孔位基因;O代表ORF1ab基因;N代表N基因;0表示還未統(tǒng)計(jì)Ct值。

1.2.5測試表格的適用性 選取強(qiáng)陽性結(jié)果多、易出現(xiàn)孔間污染的隔離點(diǎn)標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果,輸入表格,對表格中顯示為可能污染的標(biāo)本進(jìn)行雙試劑復(fù)核及2次復(fù)核,評估表格的適用性。

2 結(jié) 果

2.1設(shè)計(jì)表格可直觀顯示擴(kuò)增結(jié)果及標(biāo)識可能被污染的孔位 輸入隔離點(diǎn)027B檢測板的新型冠狀病毒核酸檢測數(shù)據(jù),圖2A在相應(yīng)孔位顯示了陽性孔的ORF1ab和N基因的Ct值,同時圖2B標(biāo)識B11為“82號位可能污染”。分析可知,B11孔可能源于A12孔污染,B11孔與A12孔兩個靶標(biāo)的Ct值差值為ORF1ab基因7.36(26.14-18.78)、N基因7.39(23.22-15.83),Ct值差值均>5,因此B11孔可能被污染;D2孔與E3孔相鄰,但其ORF1ab基因的Ct值差值為0.62(30.77-30.15)、N基因的Ct值差值為2.93(29.15-26.22),均<5,因此排除污染的可能。見圖2。

注:A為檢測板中所有陽性孔位的ORF1ab和N基因的Ct值;B為檢測板中被判為可能污染的孔位。

2.2初篩陽性孔2次新型冠狀病毒核酸復(fù)檢證實(shí)表格的適用性 對027B檢測板上所有初篩為陽性的標(biāo)本進(jìn)行雙試劑第1次和第2次復(fù)檢,結(jié)果顯示,B11孔位2次復(fù)檢結(jié)果均為陰性,D2孔位2次復(fù)檢均為陽性,證明該表格適用于實(shí)際工作中新型冠狀病毒核酸檢測的結(jié)果分析,能快速、直觀地顯示可能存在的污染孔位。見表1。

表1 隔離點(diǎn)標(biāo)本027B檢測板初篩陽性孔2次復(fù)檢結(jié)果(Ct值)

3 討 論

目前,醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室開展新型冠狀病毒核酸檢測所采用的方法以反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR法為主[11],但該方法對加樣環(huán)境和檢驗(yàn)人員要求較高,且容易造成孔間交叉污染,導(dǎo)致假陽性檢測結(jié)果[12]。由于孔間交叉污染多源于加樣和核酸提取過程中的攜帶污染和氣溶膠污染[13-14],具有偶發(fā)性,很難通過實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和風(fēng)險(xiǎn)管理進(jìn)行規(guī)避,只能通過實(shí)時分析檢測結(jié)果和多次復(fù)檢進(jìn)行評判。

本研究通過Excel軟件模擬設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)板的布局,直觀地顯示各反應(yīng)孔與其相鄰孔位的位置關(guān)系,并設(shè)置“當(dāng)陽性孔與其周邊最強(qiáng)陽性孔的雙靶標(biāo)Ct值相差≥5時,判定該孔為可能污染”的標(biāo)準(zhǔn),可準(zhǔn)確地標(biāo)識可能存在污染的孔位。

當(dāng)下,由于全國各地疫情防控政策的優(yōu)化,陸續(xù)取消了大規(guī)模、集中化的社會面核酸篩查,檢測機(jī)構(gòu)減少可能引起醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室未來一段時間內(nèi)檢出率的增加。結(jié)合該表格的使用,檢驗(yàn)人員可快速找出可能為交叉污染的標(biāo)本、及時進(jìn)行復(fù)檢。一方面減少了2次復(fù)檢的程序,縮短報(bào)告發(fā)放時間;另一方面避免了假陽性結(jié)果的發(fā)出。此外,針對定點(diǎn)治療醫(yī)院或方艙醫(yī)院等陽性標(biāo)本較集中的機(jī)構(gòu),當(dāng)初檢、復(fù)檢結(jié)果不一致時,會啟動2次復(fù)檢的流程[10],極大地增加了檢測的工作量。此時,將該表格用于分析各陽性孔是否被污染,可以避免非必要的2次復(fù)檢,減少核酸檢測工作量。

本研究判定污染的標(biāo)準(zhǔn)為“被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值≥5”,是基于檢測試劑盒擴(kuò)增效率為100%、200 μL加樣量可能攜帶或造成相鄰孔累計(jì)6.25 μL污染的假設(shè)。實(shí)際工作中,很多新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的擴(kuò)增效率≤90%[15],吸頭攜帶或氣溶膠污染量可能低于6.25 μL,因此,Ct值差值≥5的標(biāo)準(zhǔn)可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室檢測對象、檢出率等因素進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

綜上所述,基于“掃雷游戲”原理評估新型冠狀病毒核酸檢測中的孔間污染,可準(zhǔn)確、快速預(yù)測可能存在污染的孔位,避免多次復(fù)檢,減少核酸檢測工作量。