邱 巍,陳素梅,劉東聲

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院檢驗(yàn)科/江蘇省宿遷市檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇宿遷 223800

胃癌在全球各種惡性腫瘤中的發(fā)病率位于第6位、病死率位于第3位[1]。在我國各種惡性腫瘤中其發(fā)病率位居首位、病死率位居第2位。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來,是一種不能編碼蛋白質(zhì)、長度超過200 bp的RNA,在組織和細(xì)胞中表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性[2]。LncRNA H19最早被發(fā)現(xiàn)位于人類染色體11p15.5上,包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,其第5個(gè)外顯子上的Rsal多態(tài)酶切位點(diǎn)可以與胰島素樣生長因子2(IGF-2)組成H19/IGF-2印記基因群[3]。LncRNA H19在胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平較高,但出生后在大部分組織器官內(nèi)的表達(dá)水平都顯著下降[4]。LncRNA H19在不同的惡性腫瘤中發(fā)揮著作用,在部分腫瘤中有著促癌作用,如肝癌[5]、腎癌[6]、乳腺癌[7]等。本研究采用限制性片段長度多態(tài)性PCR技術(shù)分析了LncRNA H19 在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位點(diǎn)的基因型頻率分布與胃癌的易感性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2021年12月本院收治的胃癌患者265例作為胃癌組,同期健康體檢者284例作為對(duì)照組。胃癌組納入標(biāo)準(zhǔn):符合中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為胃癌;術(shù)前未經(jīng)放、化療。排除標(biāo)準(zhǔn):患有其他類型腫瘤。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)過病史詢問和實(shí)驗(yàn)室檢查排除心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤、消化系統(tǒng)疾病及其他全身性疾病。兩組人群均為宿遷地區(qū)漢族人群,年齡、性別比例相匹配且個(gè)體之間均無血緣關(guān)系。胃癌組平均年齡(65.40±11.38)歲,男192例,女73例;對(duì)照組平均年齡(64.71±4.74)歲,男222例,女62例。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。胃癌組年齡<60歲患者68例,≥60歲患者197例。對(duì)照組年齡<60歲患者59例,≥60歲患者225例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2儀器與試劑 Eppendorf 5424R離心機(jī)為德國艾本德公司生產(chǎn),Bio-Rad T100 PCR儀為美國伯樂公司生產(chǎn),DYY-8C型電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn),FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)為上海復(fù)日科技有限公司生產(chǎn),752紫外可見分光光度計(jì)為上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn),血液基因組DNA提取試劑盒為北京天根生化科技公司生產(chǎn),PCR試劑盒為大連寶生物工程有限公司生產(chǎn),酶切試劑盒為美國紐英倫生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 采集兩組研究對(duì)象空腹?fàn)顟B(tài)下5 mL EDTA-K2抗凝的全血。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,使用紫外分光光度計(jì)檢測DNA水平和純度。將提取的基因組DNA溶解于TE緩沖液中,置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2引物設(shè)計(jì) LncRNA H19在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[9]。rs217727 C>T上游引物序列:5′-GTCGCTATCTCTAGGTGAAG-3′;下游引物序列:5′-GTGGAGGCTTTGAATCTCTC-3′;產(chǎn)物片段大小為291 bp。rs2839698 C>T上游引物序列:5′-AAGGAGCACCTTGGACATCT-3′;下游引物序列:5′-CTGCCACGTCCTGTAACCAA-3′;產(chǎn)物片段大小為226 bp。

1.3.3PCR反應(yīng) 使用Takara PCR試劑盒,25.0 μL反應(yīng)體系:5 U/μL Ex Taq 0.2 μL,10×buffer(Mg2+free)2.5 μL,25 mmol/L MgCl22.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL,DNA模板2.0 μL,ddH2O補(bǔ)足體積。rs217727 C>T位點(diǎn)的循環(huán)參數(shù):94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。rs2839698 C>T位點(diǎn)的循環(huán)參數(shù):94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.3.4酶切反應(yīng) 使用NEB酶切試劑盒,rs217727 C>T位點(diǎn)的20 μL酶切體系:PCR產(chǎn)物5 μL,EciⅠ1 μL,10×NEBuffer 5 μL,ddH2O 9 μL,37 ℃酶切1 h。rs2839698 C>T位點(diǎn)的20 μL酶切體系為PCR產(chǎn)物5 μL,KasⅠ 1 μL,10× NE Buffer 5 μL,ddH2O 9 μL,37 ℃酶切1 h。使用3%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

2 結(jié) 果

2.1基因分型結(jié)果 在rs217727 C>T位點(diǎn),PCR產(chǎn)物經(jīng)EciⅠ酶切后TT基因型為291 bp的1條片段;CT基因型為145、146、291 bp的3條片段;CC型為145、146 bp的2條片段。在rs2839698 C>T位點(diǎn),PCR產(chǎn)物經(jīng)KasⅠ酶切后TT基因型為226 bp的1條片段;CT基因型為106、120、226 bp的3條片段;CC基因型為106、120 bp的2條片段。

2.2兩組基因多態(tài)性分布比較 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn),rs217727 C>T位點(diǎn)在胃癌組(χ2=0.09,P=0.762)和對(duì)照組(χ2=0.62,P=0.430),rs2839698 C>T位點(diǎn)在胃癌組(χ2=2.62,P=0.106)和對(duì)照組(χ2=0.63,P=0.427)中基因型分布均符合遺傳平衡定律。

經(jīng)Logistic回歸校正年齡、性別后胃癌組和對(duì)照組rs217727 C>T位點(diǎn)CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.33,P<0.05),與CC比較,TT純合子發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是其1.93倍(OR=1.93,95%CI=1.15～3.25);CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.97,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.46,P>0.05);胃癌組T等位基因頻率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.15,P<0.05)。兩組rs2839698 C>T位點(diǎn)CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.49,P<0.05),與CC比較,TT純合子發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是其1.91倍(OR=1.91,95%CI=1.04～3.51); CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.82,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.82,P>0.05);胃癌組T等位基因頻率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.12,P<0.05)。見表1、2。

表1 兩組rs217727 C>T位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較[n(%)]

表2 兩組rs2839698 C>T位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較[n(%)]

2.3年齡、性別與基因型頻率的關(guān)系 將胃癌組和對(duì)照組分別按年齡分層后發(fā)現(xiàn):兩組間rs217727 C>T位點(diǎn)在年齡<60歲研究對(duì)象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.58,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.11,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.90,P>0.05)。在年齡≥60歲研究對(duì)象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.29,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.95,P<0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.50,P>0.05)。兩組間男性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.63,P>0.05),CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.95,P<0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.83,P>0.05)。女性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.15,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.27,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.82,P>0.05)。見表3、4。

表3 兩組rs217727 C>T位點(diǎn)年齡與基因型頻率的關(guān)系[n(%)]

表4 兩組rs217727 C>T位點(diǎn)性別與基因型頻率的關(guān)系[n(%)]

在rs2839698 C>T位點(diǎn):年齡<60歲研究對(duì)象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.61,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.05,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.24,P>0.05)。在年齡≥60歲研究對(duì)象中CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.73,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.42,P<0.05); CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.37,P>0.05)。兩組間男性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.31,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.27,P<0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.80,P>0.05)。女性CC基因型與CT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.12,P>0.05);CC基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.19,P>0.05);CT基因型與TT基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.67,P>0.05)。見表5、6。

表5 兩組rs2839698 C>T位點(diǎn)年齡與基因型頻率的關(guān)系[n(%)]

表6 兩組rs2839698 C>T位點(diǎn)性別與基因型頻率的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

隨著研究的深入,大量研究表明,LncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其參與了基因印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的過程[10-11],從而調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為[12-14]。LncRNA H19通過不同的調(diào)節(jié)機(jī)制在不同類型的腫瘤中發(fā)揮促癌作用。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類最常見的遺傳變異,主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列的改變。有研究發(fā)現(xiàn),LncRNA上的功能性SNP位點(diǎn)可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響LncRNA的表達(dá),從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[15]。

在本研究中,LncRNA H19 rs217727 C>T位點(diǎn)在胃癌組的等位基因T頻率為0.440,顯著高于對(duì)照組的0.366(χ2=6.15,P<0.05);rs2839698 C>T位點(diǎn)在胃癌組的等位基因T頻率為0.309,顯著高于對(duì)照組的0.248(χ2=5.12,P<0.05)。兩個(gè)位點(diǎn)中胃癌組和對(duì)照組TT基因型與CC基因型頻率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與CC比較, rs217727 C>T位點(diǎn)TT純合子有1.93倍的胃癌風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.93,95%CI=1.15～3.25),rs2839698 C>T位點(diǎn)TT純合子有1.91倍的胃癌風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.91,95%CI=1.04～3.51),說明rs217727 C>T和2839698 C>T位點(diǎn)中的突變T等位基因可能是胃癌的危險(xiǎn)因素。兩個(gè)位點(diǎn)在年齡≥60歲男性中CC基因型與TT基因型頻率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位點(diǎn)中的基因型變異使發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加,在年齡≥60歲的男性中更為顯著。這可能與累積暴露于存在致癌物的環(huán)境中及老年人的免疫系統(tǒng)較弱相關(guān)。YANG等[16]關(guān)于中國漢族人群LncRNA H19多態(tài)性與胃癌相關(guān)性的研究結(jié)果顯示,在rs217727和rs2839698位點(diǎn)中的基因型變異在<59歲的人群中更為顯著。這一結(jié)論與本研究結(jié)果相反,還需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。PEI等[9]在對(duì)LncRNA H19的遺傳變異與中國臺(tái)灣地區(qū)兒童白血病的易感性研究中發(fā)現(xiàn), SNP rs2839698位點(diǎn)與兒童白血病有關(guān)聯(lián)性,而rs217727位點(diǎn)則無相關(guān)性。LI等[17]在LncRNA H19遺傳變異與中國人群結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系研究中報(bào)道,rs2839698位點(diǎn)與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān),rs3024270、rs217727和rs2735971位點(diǎn)與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。TAN等[18]在LncRNA H19多態(tài)性與中國人群肝母細(xì)胞瘤風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究中報(bào)道,rs2839698、rs3024270和rs217727基因多態(tài)性與中國漢族人群肝母細(xì)胞瘤易感性相關(guān)。LncRNA H19基因多態(tài)性與腫瘤的遺傳易感性研究結(jié)論不盡相同,這可能與研究對(duì)象的樣本量、代表性和遺傳背景有關(guān)。腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因的變異,研究單個(gè)基因的SNP往往存在一定的局限性。