牛芳蕾,劉紅霞

1.延安大學(xué)咸陽醫(yī)院婦科,陜西咸陽 712000;2.陜西省神木市醫(yī)院婦科,陜西榆林 719300

卵巢癌屬于婦科臨床上較為常見的惡性腫瘤,具有惡性程度高、治療難度大等特點(diǎn),嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。該病發(fā)病早期具有極強(qiáng)的隱匿性,患者往往無典型癥狀,大部分患者首次確診已是中晚期,喪失了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)[2]?；熓悄壳芭R床上治療中晚期卵巢癌的重要手段之一,化療效果直接影響患者的預(yù)后。微小核糖核酸(miRNA)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA,廣泛介導(dǎo)了人體內(nèi)正常細(xì)胞的生物學(xué)行為[3-4]。miR-21屬于miRNAs家族成員之一,已有研究表明其可能發(fā)揮類似促癌基因的作用[5]。而miR-145亦是miRNAs家族成員之一,相關(guān)研究證實(shí)其可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用[6]。但卵巢癌患者血清miR-21、miR-145表達(dá)水平及其對化療效果及預(yù)后的評估作用尚不明確,鑒于此,本研究旨在探討血清miR-21、miR-145表達(dá)水平對卵巢癌化療患者療效及預(yù)后的評估價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年3月至2019年3月延安大學(xué)咸陽醫(yī)院收治的80例卵巢癌化療患者作為研究對象?；颊吣挲g35～78歲,平均(56.27±10.62)歲;體質(zhì)量指數(shù)18～32 kg/m2,平均(23.51±1.76)kg/m2;分化程度:低分化35例,中高分化45例;TNM分期:Ⅱ期49例,Ⅲ～Ⅳ期31例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例;組織學(xué)類型:漿液性49例,黏液性31例。按照化療效果的差異將其分為部分緩解(PR)組41例,疾病穩(wěn)定(SD)組22例,疾病進(jìn)展(PD)組17例。療效判斷標(biāo)準(zhǔn):PR即病灶縮小>30%,無其他病變,且持續(xù)超過1個(gè)月;SD即病灶縮小≤30%或病灶增大<20%;PD即病灶增大≥20%或出現(xiàn)新病灶[7]。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)有明確病理檢查結(jié)果,且為首次化療;(2)具備完善的病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有其他惡性病變;(2)心、肺等臟器功能嚴(yán)重異常;(3)神志異常;(4)因故無法完成隨訪或退出;(5)存在化療禁忌證。本研究患者均知情且簽署同意書,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1患者臨床資料收集 借助醫(yī)院病歷系統(tǒng)完成各項(xiàng)基線資料的記錄、統(tǒng)計(jì),包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)、分化程度、TNM分期、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。

1.2.2給藥方案 包括TC方案(卡鉑聯(lián)合紫杉醇)以及TP方案(順鉑聯(lián)合紫杉醇)。(1)TC方案即予以紫杉醇注射液靜脈滴注,給藥劑量為175 mg/m2,首次治療靜脈滴注3 h;卡鉑按照濃度-時(shí)間曲線的曲線下面積為5計(jì)算后進(jìn)行靜脈滴注。以21 d為1個(gè)療程,連續(xù)治療2個(gè)療程。(2)TP方案即予以紫杉醇注射液260 mg/m2+順鉑75 mg/m2。給藥方式均為靜脈滴注,以21 d為1個(gè)療程,連續(xù)治療2個(gè)療程。

1.2.3標(biāo)本采集 抽取所有患者化療6個(gè)周期后的晨起進(jìn)食前靜脈血5 mL,離心處理(離心半徑8 cm,離心速度3 500 r/min,離心時(shí)長10 min)后,獲取上層血清。

1.2.4指標(biāo)檢測 采用RNA提取試劑盒(賽默飛中國有限公司,生產(chǎn)批號:015244)提取總RNA,之后以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛中國有限公司,生產(chǎn)批號:015129)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄,獲取cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-21、miR-145表達(dá)水平。反應(yīng)條件:反應(yīng)體系20.0 μL,其中cDNA模板2.0 μL,上下游引物各0.8 μL,ddH2O 6.4 μL,miScript SYBR Green Mix 10.0 μL。反應(yīng)參數(shù):95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。其中miR-21、miR-145與內(nèi)參U6的引物均由天根生化科技有限公司設(shè)計(jì)合成。所有樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔,以2-ΔΔCt法完成血清miR-21、miR-145相對表達(dá)量的計(jì)算。miR-21上下游引物序列分別如下:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,5′-GCCGCTAGCTTA TCAGACTGATGT-3′;miR-145上下游引物序列分別如下:5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′,5′-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3′。

1.3隨訪 對所有患者均開展為期3年的隨訪,隨訪方式為門診復(fù)查隨訪以及電話隨訪,隨訪內(nèi)容為患者預(yù)后情況。隨訪頻率為每3個(gè)月1次,隨訪截至患者死亡或3年期滿。根據(jù)隨訪結(jié)果,將患者分為死亡組及存活組。

1.4觀察指標(biāo) (1)比較不同化療效果以及預(yù)后患者的血清miR-21、miR-145表達(dá)水平。(2)比較不同預(yù)后患者的各項(xiàng)基線資料,分析卵巢癌化療患者預(yù)后的影響因素。(3)分析血清miR-21、miR-145表達(dá)水平預(yù)測卵巢癌化療患者預(yù)后的效能。

2 結(jié) 果

2.1不同化療效果患者血清miR-21、miR-145表達(dá)水平比較 PR組、SD組血清miR-21表達(dá)水平低于PD組,且PR組血清miR-21表達(dá)水平低于SD組,PR組、SD組血清miR-145表達(dá)水平高于PD組,且PR組血清miR-145表達(dá)水平高于SD組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同化療效果患者血清miR-21、miR-145表達(dá)水平比較

2.2影響卵巢癌化療患者預(yù)后的單因素分析 經(jīng)隨訪,患者死亡20例、存活60例。單因素分析發(fā)現(xiàn):兩組年齡、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及血清miR-21、miR-145表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而兩組體質(zhì)量指數(shù)、組織學(xué)類型比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 影響卵巢癌化療患者預(yù)后的單因素分析或n(%)]

2.3卵巢癌化療患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析 采用非條件Logistic回歸將卵巢癌化療患者預(yù)后情況視作因變量,賦值為死亡=1,存活=0。以年齡、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血清miR-21、miR-145表達(dá)水平為自變量。考慮到樣本量較少,將所有自變量均轉(zhuǎn)換為二分類變量(即自變量降維),利于穩(wěn)健回歸。經(jīng)多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn):年齡≥60歲、低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血清miR-21表達(dá)水平>3.5、血清miR-145表達(dá)水平<3.5為卵巢癌化療患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 卵巢癌化療患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4血清 miR-21、miR-145表達(dá)水平預(yù)測卵巢癌化療患者預(yù)后的ROC曲線分析 以死亡組(20例)為陽性樣本,存活組(60例)為陰性樣本,建立ROC曲線預(yù)測分析模型。兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)參考臨床實(shí)踐劃分成若干個(gè)組段,再以軟件擬合為ROC曲線讀取約登指數(shù)最大值點(diǎn),對應(yīng)計(jì)算理論閾值和各項(xiàng)參數(shù)。并按實(shí)測樣本計(jì)算靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度。聯(lián)合應(yīng)用(LogP模式)以Logistic回歸將血清miR-21、miR-145表達(dá)水平作為自變量,建立風(fēng)險(xiǎn)評估/預(yù)測回歸模型(表4),以Log(P/1-P)=-0.043+0.097×XmiR-21表達(dá)水平-0.074×XmiR-145表達(dá)水平為聯(lián)合應(yīng)用的虛擬概率量指標(biāo),再進(jìn)行ROC曲線分析。分析結(jié)果顯示:血清miR-21、miR-145兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)曲線下面積(AUC)分別為0.734(95%CI:0.479～0.990)、0.702(95%CI:0.437～0.968)、0.844(95%CI:0.717～0.960),聯(lián)合應(yīng)用的診斷效能最高,AUC及靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均較各單項(xiàng)指標(biāo)有明顯提升。見表5和圖1。

圖1 血清miR-21、miR-145預(yù)測卵巢癌化療患者預(yù)后的ROC曲線

表4 血清 miR-21、miR-145聯(lián)合預(yù)測卵巢癌化療患者預(yù)后的LogP模型構(gòu)建

表5 血清miR-21、miR-145預(yù)測卵巢癌化療患者預(yù)后的效能分析

3 討 論

目前,有關(guān)卵巢癌的具體發(fā)病機(jī)制及病因尚未徹底闡明[8]。雖然近年來針對卵巢癌的治療手段已明顯進(jìn)步,且治療效果亦有一定提升,但仍有部分患者治療后復(fù)發(fā),且生存率并未獲得顯著提升。因此,研究和疾病轉(zhuǎn)歸有關(guān)的敏感指標(biāo)對制訂疾病治療策略具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn),大約有1/2的人類miRNA定位在與腫瘤密切相關(guān)的基因組,且能通過調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程,提示了miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[9]。miR-21[10]、miR-145[11]是目前國內(nèi)外研究較多的miRNA,在胃癌、肝癌及肺癌等多種腫瘤中存在異常表達(dá)。其中miR-21可能在惡性腫瘤中扮演著促癌基因的角色,而miR-145可能扮演著抑癌基因的角色,二者均可通過對相關(guān)下游靶基因或蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

本研究結(jié)果顯示,化療后效果較好的患者血清miR-21表達(dá)水平低于效果較差的患者,而miR-145表達(dá)水平高于效果較差的患者。這提示了血清miR-21、miR-145表達(dá)水平與卵巢癌患者化療效果密切相關(guān),即隨著miR-21表達(dá)水平的升高以及miR-145表達(dá)水平的降低,患者化療效果越差。究其原因:miR-21可能通過調(diào)節(jié)β-catenin通路活性,進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力,從而增加臨床治療難度,當(dāng)其表達(dá)水平異常升高時(shí),往往反映了患者病情加劇,從而難以從標(biāo)準(zhǔn)劑量藥物中獲益,最終影響化療效果[12]。miR-145可發(fā)揮減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量,抑制腫瘤干細(xì)胞特性等作用,當(dāng)其表達(dá)水平下降時(shí),其抑癌作用下降,腫瘤細(xì)胞增殖、分化加劇,且為腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移提供了重要基礎(chǔ),最終導(dǎo)致化療效果欠佳[13]。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)隨訪3年后,80例患者中死亡20例,存活60例。經(jīng)多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn):年齡≥60歲、低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血清miR-21表達(dá)水平>3.5、血清miR-145表達(dá)水平<3.5均為卵巢癌化療患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。究其原因,隨著年齡的不斷增長,患者機(jī)體抵抗力及免疫力均會(huì)出現(xiàn)不同程度的降低,且對化療的耐受性下降,因此可能影響化療效果,最終不利于疾病轉(zhuǎn)歸。分化程度越低、TNM分期越晚以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生均會(huì)導(dǎo)致患者病情加劇,損壞患者卵巢功能,從而增加臨床治療難度,導(dǎo)致預(yù)后不良。而miR-21可通過激活Wnt信號通路調(diào)節(jié)CD44v6的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的自噬,促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,最終影響預(yù)后[14-15]。miR-145可能通過靶向調(diào)控SOX11基因的表達(dá),進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的生長,發(fā)揮類似于抑癌基因的作用[16-18]。另外,經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn):血清 miR-21、miR-145聯(lián)合預(yù)測卵巢癌化療患者預(yù)后的效能優(yōu)于上述兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測。這反映了聯(lián)合檢測血清miR-21、miR-145表達(dá)水平對卵巢癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值較高?？赡苁锹?lián)合檢測上述兩項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)水平,可為臨床預(yù)測患者預(yù)后提供較為全面的依據(jù),最終提高預(yù)測效能。這也充分提示了聯(lián)合檢測更具應(yīng)用價(jià)值[19-20]。

綜上所述,隨著血清miR-21表達(dá)水平的升高以及miR-145表達(dá)水平的降低,卵巢癌化療患者效果越差,且預(yù)后相對不良。因此,臨床工作中可通過檢測上述兩項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)水平,進(jìn)而為療效評估以及預(yù)后預(yù)測提供參考依據(jù)。