王曉鳳,沈依帆,詹 茜,廖 鑫,吳 江,趙 潔,楊梓涵,江 珊,程 偉,張玉洪,陳雪萍

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分子醫(yī)學(xué)檢測中心,重慶 400016

急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)均是造血系統(tǒng)的髓系原始細(xì)胞克隆性惡性增殖性疾病,是一類具有高度異質(zhì)性的疾病群。目前,隨著靶向治療藥物的誕生,靶向治療成為熱點。研究發(fā)現(xiàn),AML和MDS存在多種驅(qū)動基因突變[1]。較常見的突變基因包括FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、NRAS、KRAS、RUNX1、TET2、TP53、CEBPA等?；隍?qū)動基因突變對AML及MDS患者的靶向治療和預(yù)后分層已經(jīng)寫入相關(guān)指南/共識[2]并在臨床診療中實踐。AML和MDS的基因突變譜特征有差異,與臨床鑒別診斷、治療監(jiān)測有關(guān),但關(guān)于西南地區(qū)乃至全國人群的報道較少。高通量測序技術(shù)(NGS)作為新型的分子生物技術(shù),具有高通量、高靈敏度、高重復(fù)性等特點,幾乎所有患者均可篩查出相關(guān)基因突變,對于AML和MDS在分子水平鑒別有一定的優(yōu)勢[3]。

因此,本研究采用NGS對初診為髓系白血病的患者進(jìn)行髓系血液腫瘤相關(guān)的基因檢測,并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分化抗原,對與AML和MDS診斷相關(guān)的高表達(dá)抗原分子進(jìn)行統(tǒng)計與分析,篩選陽性率較高的DNMT3A、FLT3、NPM1、SRSF2、RUNX1、IDH1、TET2、GATA2等基因[2]作為候選研究基因,總結(jié)基因突變頻譜,分析基因突變與患者基線資料和臨床診斷的相關(guān)性,探討AML和MDS的差異性基因指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年9月至2022年12月收治的髓系白血病患者作為研究對象,其中71例AML患者和34例MDS患者。將AML和MDS患者分別按年齡進(jìn)行分組,年齡≥60歲納入老年組,年齡<60歲納入中青年組。所有研究對象均經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、流式免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)(MICM)檢測,并結(jié)合臨床表現(xiàn),符合現(xiàn)行的AML和MDS診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)[2-4],且均進(jìn)行了相關(guān)基因的NGS突變譜檢測。將NGS檢測結(jié)果中在本次研究范圍內(nèi)的高頻次基因突變的患者納入病例組。排除既往或復(fù)發(fā)患者;合并其他相關(guān)疾病患者;多種腫瘤患者;合并心、肺、肝、腎功能障礙者;合并全身感染性疾病患者;門診患者或沒有詳細(xì)基礎(chǔ)資料和治療史的患者;本次研究范圍外的基因突變患者。

1.2儀器與試劑 儀器:移液器(Eppendorf)、熒光定量儀QubitR 3.0 Fluorometer、渦旋混勻器(其林貝爾QB-328)、恒溫金屬浴(奧盛MiniT-H2C)、微型高速離心機(jī)(Mini-15K)、梯度PCR儀(Tadvanced 96G)、二代測序儀(Illumina miniseq,NextSeq CN500)、流式細(xì)胞儀(Navios)。試劑:源奇AML/MDS/MPN相關(guān)38基因突變檢測試劑盒、血液腫瘤相關(guān)基因突變檢測試劑盒(100+)、天根血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、新百基核酸提取或純化試劑(M2002-A32)、貝克曼庫爾特抗體、BD抗體、北京化工無水乙醇(分析純)、無核酸酶水。

1.3方法 常規(guī)抽取患者骨髓2～4 mL,保存于普通乙二胺四乙酸抗凝采血管中,取樣后常溫(15～35 ℃)或2～8 ℃運輸,24 h內(nèi)送至實驗室進(jìn)行骨髓DNA的抽提。再通過構(gòu)建原始DNA文庫,擴(kuò)增目的片段,純化PCR,連接接頭及制備富集文庫,采用二代測序儀進(jìn)行基因測序,測序后的原始數(shù)據(jù)利用千人基因組、Cosmic、ClinVar、dbSNP等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析,確定致病性突變基因位點。白細(xì)胞計數(shù)采用患者初診時的血細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果,細(xì)胞表面分化抗原分型結(jié)果基于本中心流式細(xì)胞儀對患者初診時的免疫細(xì)胞分型進(jìn)行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗,本研究中計量資料均不符合正態(tài)分布,以M(P25,P75)表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AML及MDS患者不同年齡組的基線資料比較 AML患者中老年組21例,中位年齡68歲,中青年組50例,中位年齡45歲,兩組年齡比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);AML患者中老年組男性占比為76.2%,中青年組男性占比為38.0%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDS患者中老年組11例,中位年齡72歲,中青年組23例,中位年齡55歲,兩組年齡比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);MDS患者中老年組男性占比為54.5%,中青年組男性占比為65.2%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩類患者不同年齡組的白細(xì)胞計數(shù)及流式細(xì)胞分化抗原CD7、CD11b、CD56比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1～2。

表1 AML患者不同年齡組基線資料比較[M(P25,P75)或n(%)]

表2 MDS患者不同年齡組基線資料比較[M(P25,P75)或n(%)]

2.2AML和MDS基因突變譜 本研究采用NGS對診斷AML和MDS有意義的常見基因進(jìn)行測序。通過統(tǒng)計學(xué)方法遴選出其中突變比例較高的基因主要為ASXL1、CEBPA、TP53、DNMT3A、FLT3、NPM1、SRSF2、RUNX1、IDH1、TET2、FLT3-ITD、FLT3-TKD、GATA2等基因,涵蓋了髓系白血病常見的突變基因。分析發(fā)現(xiàn),在AML中DNMT3A基因突變與年齡有一定關(guān)系,DNMT3A基因在老年組AML患者中的突變頻率為38.1%,而該指標(biāo)在中青年組AML患者中的突變頻率為12.0%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但其他高頻突變基因在AML和MDS患者不同年齡分組中比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3～4。

表3 AML患者不同年齡組基因突變頻率比較[n(%)]

表4 MDS患者不同年齡組基因突變頻率比較[n(%)]

2.3AML和MDS基因突變差異性特點 CEBPA基因在AML和MDS中的突變頻率分別為23.9%和2.9%;FLT3基因在AML和MDS中的突變頻率分別為32.4%和11.8%;RUNX1基因在AML和MDS中的突變頻率分別為9.9%和26.5%。AML和MDS患者CEBPA、FLT3、RUNX1、FLT3-TKD基因突變頻率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AML和MDS患者NPM1和ASXL1等基因突變頻率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 AML與MDS患者中各基因突變頻率比較[n(%)]

3 討 論

本回顧性研究結(jié)果顯示,在初診為髓系白血病患者中,老年組(年齡≥60歲)發(fā)生相應(yīng)基因突變頻率高于中青年組:老年組AML患者中ASXL1、TP53、DNMT3A、NPM1、SRSF2等基因突變頻率高于中青年組;而在老年組MDS患者中CEBPA、DNMT3A、FLT3、SRSF2、RUNX1、IDH2等基因變頻率高于中青年組。有研究顯示,AML的中位發(fā)病年齡為67歲[5]。老年AML患者占AML患者的一半以上[6-7];老年患者發(fā)生MDS可能與隨年齡增長的進(jìn)行性造血功能衰退和突變積累有關(guān)[6-7],因此,上述基因是否可以作為西南地區(qū)AML和MDS鑒別診斷的依據(jù),可以擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行研究。同時,本研究發(fā)現(xiàn),性別與疾病的發(fā)生也有一定的關(guān)系,AML患者中老年組男性占比高達(dá)76.2%,而在MDS患者中中青年組和老年組男性占比均過半,可能與男性的不良生活習(xí)慣有一定關(guān)系,但由于樣本量較少,未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果,還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來驗證。

本研究西南地區(qū)髓系白血病患者NGS檢測結(jié)果聯(lián)合流式細(xì)胞分化抗原結(jié)果顯示:NGS檢測結(jié)果與報道過的中國人群髓系白血病基因突變譜一致,高頻突變基因主要是ASXL1、CEBPA、TP53、DNMT3A、FLT3、NPM1、SRSF2、RUNX1、IDH1、TET2等,符合我國人群基因突變譜[8-11]。這些高頻突變基因也是美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南中提及的與血液腫瘤的診斷密切相關(guān)的基因[2]。在本研究中,AML和MDS患者單個基因突變比較,AML患者CEBPA、FLT3、NPM1、IDH1等基因突變頻率高于MDS患者,MDS患者ASXL1、RUNX1等基因突變頻率高于AML患者。CEBPA[12-14]、RUNX1[15-16]、ASXL1基因[17]的突變檢測均可作為髓系白血病鑒別診斷的指標(biāo)之一。而本研究發(fā)現(xiàn),NPM1、SRSF2、DNMT3A、GATA2、TP53等基因突變頻率在兩種疾病之間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與相關(guān)研究結(jié)果略有不符[3,18],可能與西南地區(qū)人群特殊的飲食習(xí)慣和生活作息有關(guān),以上基因是否可以作為AML和MDS的鑒別診斷依據(jù)還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。由上述對比可見:AML和MDS患者的基因突變譜明顯不同,利用這些基因的差異性突變,結(jié)合NGS技術(shù)可在髓系血液腫瘤的前期診斷、發(fā)病機(jī)制研究、驅(qū)動基因的發(fā)現(xiàn)等方面發(fā)揮重要作用。

NGS具有靈敏度高、通量高的優(yōu)點,可同時檢測多個基因、多個位點、多種突變形式,大大降低了對樣本量的要求,并且可以構(gòu)成不同的基因組合,有利于醫(yī)生對基因和項目的選擇,臨床應(yīng)用的空間大,而且?guī)缀跛械幕颊叨寄芎Y查出基因突變,這在早期診斷和治療中有較高的價值。目前,已經(jīng)有大量研究報道NGS可用于髓系白血病的診斷、個性化治療和微小殘留灶(MRD)的監(jiān)測[19-20]。盡管國外已經(jīng)進(jìn)行了大批量樣本的研究,但對我國尤其是西南地區(qū)人群的研究仍然可以發(fā)現(xiàn)新的、不同于國外人群的特征。尤其是在NGS測序完成后,生物信息分析人員在對臨床意義尚未明確的變異結(jié)果進(jìn)行解讀時,是否可以結(jié)合我國人群基因數(shù)據(jù)庫來解讀可以作為后期的研究方向。因為我國人群的遺傳方式、生活飲食習(xí)慣及環(huán)境因素與西方人不同,而用現(xiàn)在的數(shù)據(jù)庫來解釋我國人群基因突變譜其可靠性會略低。因此,將基因檢測數(shù)據(jù)與臨床資料整合起來,建立符合西南地區(qū)乃至我國人群的基因數(shù)據(jù)庫具有非常重要的意義。但基于二代測序儀的NGS具有建庫流程煩瑣,測序時間長,每次只能添加1個dNTP的特點,雖然能夠很好地解決測量同聚物長度準(zhǔn)確率低的問題,但它的主要測序錯誤來源是堿基的替換,錯誤率較高;而讀長短(200～500 bp)的特點也讓其應(yīng)用存在局限性。

綜上所述,利用NGS綜合分析比較西南地區(qū)AML和MDS兩種疾病MICM的差異,并結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)及臨床基本資料,后續(xù)再結(jié)合臨床治療方案、轉(zhuǎn)歸及患者生存資料進(jìn)行歸納分析,有益于建立西南地區(qū)AML和MDS患者的基因數(shù)據(jù)庫,致力于AML和MDS的精準(zhǔn)診斷、預(yù)后分層及MRD的監(jiān)測,有助于理解兩種疾病分子層發(fā)病機(jī)制的異同。