鄭朵 楊麗娟 林娜

【摘要】 目的 探討白介素-10（IL-10）基因啟動子rs1800896和rs1800871位點基因多態(tài)性與黑衣壯兒童支氣管哮喘關(guān)系和不同地域種族比較。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)和直接測序法，對 156例受試者（黑衣壯哮喘兒童78例和黑衣壯健康兒童78例）IL-10基因啟動子rs1800896和rs1800871位點，通過統(tǒng)計學(xué)方法分析各基因型及等位基因頻率，比較組間差異，并與不同地域種族比較。結(jié)果 哮喘組各基因型及等位基因頻率與健康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。廣西黑衣壯兒童各位點基因型和等位基因頻率與人類基因組計劃公布的非洲尼日利亞人、非洲尼日利亞伊巴丹的魯巴人、西班牙伊比利亞人、美國休斯敦的古吉拉特印第安人相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與中國南方漢人相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 IL-10基因位點rs1800896和rs1800871位點的多態(tài)性可能與廣西黑衣壯族患兒支氣管哮喘無相關(guān)，與不同種族和地域相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 支氣管哮喘；單核苷酸多態(tài)性；白細(xì)胞介素10；兒童；種族

中圖分類號：R725.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.06.007

A study on relationship between polymorphisms at the rs1800896 and rs1800871 loci of interleukin-10 gene promoter and bronchial asthma in black clothed Zhuang children

ZHENG Duo^{1， 2}， YANG Lijuan¹， LIN Na^1▲

（1. Department of Pediatrics， Affiliated Hospital of Youjiang Medical? University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 2. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate relationship between polymorphisms at the rs1800896 and rs1800871 loci of interleukin-10 （IL-10） gene promoter and bronchial asthma in black clothed Zhuang children， and to compare different regions and races. Methods Polymerase chain reaction and direct sequencing were used to analyze the frequencies of the rs1800896 and rs1800871 loci of interleukin-10 gene promoter in 156 subjects （78 black clothed Zhuang children with asthma and 78 healthy black clothed Zhuang children） through statistical methods. And then， difference between groups as well as difference between regions and races were compared. Results There was no statistically significant difference in genotype and allele frequencies between asthma group and healthy group （P>0.05）. The differences between genotype and allele frequencies of Guangxi black clothed Zhuang children at each point and and those of Nigerians of Africa （ESN）， Yoruba people in Ibadan of Nigeria of Africa（YRI）， Iberians in Spain （IBS）， and Gujarat Indians in Houston of America （GIH） announced by the Human Genome Project were statistically significant（P<0.01）. While comparing with those of the ?Chinese Han southerner （CHS）， the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion The polymorphisms at the rs1800896 and rs1800871 loci of the IL-10 gene may not be associated with bronchial asthma in black clothed Zhuang children of Guangxi， but they may be associated with different races and regions.

【Key words】 bronchial asthma; single nuleotide polymorphism （SNP）; interleukin-10 （IL-10）; children; race

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，以反復(fù)發(fā)作的喘息咳嗽、氣促、胸悶為主要臨床表現(xiàn)，常在夜間和（或）凌晨發(fā)作或加劇，常伴有可變的呼氣性氣流受限。研究^［1］發(fā)現(xiàn)，遺傳方面存在多種基因多態(tài)性會影響支氣管哮喘的易感性。其中編碼白細(xì)胞介素-10（IL-10）的基因位于人類基因組的 1 號染色體長臂 （q31-q32），由四個內(nèi)含子和五個外顯子組成，跨度約為 4.7 kb。這是一個與哮喘易感性相關(guān)的區(qū)域^［2-5］。IL-10啟動子區(qū)域內(nèi)存在三種常見的單核苷酸多態(tài)性（single nuleotide polymorphism，SNP），包括rs1800896、rs1800871和rs1800872^［4］。與該基因其他多態(tài)性的連鎖不平衡（LD），能夠調(diào)節(jié) IL-10的表達(dá)，影響其血清學(xué)水平，與深靜脈血栓形成、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、幽門螺桿菌引起的胃十二指腸疾病和急性胰腺炎、克羅恩病、銀屑病及支氣管哮喘相關(guān)^{［2， 5］}。已證實哮喘發(fā)病與SNP相關(guān)。然而，未見到IL-10基因多態(tài)性與廣西地區(qū)黑衣壯族支氣管哮喘患兒的相關(guān)性報道。本研究旨在探討IL-10基因多態(tài)性與黑衣壯族兒童支氣管哮喘之間的關(guān)系以及與不同種族和地域人種的關(guān)系。

1 對象及方法

1.1 研究對象

選取于2021年1月25日至2021年10月28日，就診于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科門診及住院部的黑衣壯族支氣管哮喘兒童以及同期健康體檢的黑衣壯族兒童作為研究對象，從100例支氣管哮喘患兒和100例健康體檢兒童數(shù)據(jù)中通過統(tǒng)計學(xué)隨機(jī)數(shù)表法，分別隨機(jī)選取78例，均為廣西地區(qū)本地人口，祖孫三代及三代以上均為廣西黑衣壯族，無血緣關(guān)系，無異族通婚史。其中哮喘組78例，男孩57例，女孩21例，最小月齡5個月，最大月齡135個月，平均為（51.0±26.9）個月，均經(jīng)臨床、實驗室等檢查確診為支氣管哮喘，符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版） 》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；正常健康組為78例同期健康體檢黑衣壯族兒童，男孩49例，女孩29例，最小月齡15個月，最大月齡111個月，平均為（49.5±22.4）個月。所有患兒家屬已簽署知情同意書，自愿參與本項目的研究，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 主要的試劑和儀器

PCR儀-A300（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；3730 XL基因測序儀（ABI公司）；Allegra 25R臺式高速冷凍離心機(jī)（Beckman〔貝克曼〕公司）；Micro 17R微量臺式離心機(jī)（Thermo〔賽默〕公司）；微量可調(diào)移液器（Eppendorf公司）；Taq DNA ligase（NEB公司）；PCR MIX（上海翊圣生物科技有限公司）；人血液基因組DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 采集樣本和提取DNA

采集研究對象2 mL外周靜脈血，存放于EDTA抗凝管中，采用離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司），提取靜脈血中DNA，置于-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 設(shè)計和合成引物

根據(jù)數(shù)據(jù)庫（NCBI）和通過Primer Premier 5軟件，委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行設(shè)計和合成引物，IL-10基因rs1800896位點和rs1800871位點引物見表1，引物擴(kuò)增檢測見圖1。

1.3.3 檢測目的基因分型

采用聚合酶鏈反應(yīng)對IL-10基因啟動子rs1800896和rs1800871位點進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系采用15 μL，模板DNA 1 μL，引物F 0.3 μL，引物R 0.3 μL，2×PCR MIX 7.5 μL，雙蒸水5.9 μL，補(bǔ)至15 μL。PCR反應(yīng)采用PCR儀-A300，反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系于95 ℃預(yù)變性5 min后，按程序94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 90 s，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后70 ℃延伸3 min。連接酶檢測反應(yīng)（LDR）：采用反應(yīng)體系10 μL，PCR產(chǎn)物3 μL，10* Taq DNA ligase 緩沖液（美國NEB公司）1 μL，Taq DNA ligase（40 U/μL）0.125 μL，探針（10 μM） 0.2 μL /條，雙蒸水補(bǔ)充至10 μL。循環(huán)條件：由94 ℃變性 20 s→58 ℃退火 90 s擴(kuò)增30個循環(huán)。取1 μL產(chǎn)物，加9 μL上樣緩沖液，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀3730 XL進(jìn)行測序。采用 GeneMarker軟件分析模板DNA的SNP。

1.4 不同種族和地域人種基因多態(tài)性數(shù)據(jù)

通過在線 ensemble基因數(shù)據(jù)庫（http：//asia.ensembl.org/index.html），獲取千人基因組計劃中不同種族和地域人種IL-10基因啟動子rs1800896和rs1800871位點的基因多態(tài)性分布數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

各位點進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗驗證樣本的群體代表性;通過基因計數(shù)法直接計算哮喘組和健康組的基因型和等位基因的頻率;計數(shù)資料的比較采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行χ²檢驗，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05;采用單變量logistic回歸進(jìn)一步分析哮喘組和健康組的不同基因位點多態(tài)性相對于哮喘的相對危險程度。

2 結(jié)果

2.1 群體遺傳Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗

經(jīng) Hardy-Weinberg平衡檢驗分析，結(jié)果顯示：IL-10基因位點rs1800896哮喘組（χ²=0.228，P=0.633），健康組（χ²=0.542，P=0.462）；rs1800871哮喘組（χ²=3.237，P=0.072），健康組（χ²=1.022，P=0.312）；結(jié)果表明所選擇樣本均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，且具有群體代表性（P>0.05）。

2.2 IL-10基因rs1800896和rs1800871各位點基因峰型圖

rs1800896基因位點分型檢測結(jié)果檢出TT、CT基因型，未檢出CC基因型，各基因型峰型圖見圖2。rs1800871基因位點分型檢測結(jié)果分別檢出AA、GG、AG三種基因型，各基因型峰型圖見圖3。

2.3 兩組IL-10基因位點rs1800896和rs1800871各位點基因型和等位基因頻率

對哮喘組和健康組IL-10基因位點rs1800896和rs1800871各位點基因型和等位基因頻率進(jìn)行分析，結(jié)果表明：廣西黑衣壯族兒童哮喘組IL-10基因位點rs1800896，基因型TT、CT和CC的分布與健康組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ²=0.918，P=0.338），且等位基因與健康組相比較，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（χ²=0.855，P=0.355）；IL-10基因位點rs1800871，基因型AA、AG和GG的分布與健康組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ²=0.891，P=0.640），且等位基因與健康組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ²=0.366，P=0.545）。見表2、表3。

2.4 IL-10基因位點rs1800896和rs1800871各位點多態(tài)性對哮喘的相對危險度

IL-10基因位點rs1800896和rs1800871位點多態(tài)性對哮喘的相對危險度。單變量logistic回歸分析兩個位點基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)系，結(jié)果顯示：rs1800896位點相對于TT基因型而言，CT和CT+CC基因型均不能增加哮喘發(fā)生的危險性，OR值（95% CI）分別為0.628（0.242～1.635）、0.667（0.258～1.720）；rs1800871位點相對于AA基因型而言，AG、GG和AG+GG基因型均不能增加哮喘發(fā)生的危險性，OR值（95% CI）分別為0.965（0.502～1.856）、0.538（0.144～2.013）、0.900（0.477～1.699）。見表4。

2.5 IL-10基因位點rs1800896和rs1800871各位點基因型及等位基因與不同地區(qū)種族人群的比較

結(jié)果表明，IL-10基因位點rs1800896的基因型和等位基因頻率與ＥＳＮ（非洲尼日利亞人）、YRI（非洲尼日利亞伊巴丹的魯巴人）、IBS（西班牙伊比利亞人）、GIH（美國休斯敦的古吉拉特印第安人）的基因型和等位基因頻率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與CHS（中國南方漢人）的基因型和等位基因頻率對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表5和表6；IL-10基因位點rs1800871的基因型和等位基因頻率與ESN、YRI、IBS、GIH的基因型和等位基因頻率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與CHS的基因型和等位基因頻率對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表7和表8。

3 討論

IL-10是一種多效性細(xì)胞因子，可以抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，預(yù)防過敏性氣道高反應(yīng)性和炎癥，通過限制宿主對病原體的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步防止對宿主造成損害并維持正常的組織穩(wěn)態(tài)，從而在哮喘中發(fā)揮保護(hù)作用^{［2，3，5，6］}。國外KORPPI等人研究發(fā)現(xiàn)，IL-10基因啟動子 rs1800896、rs1800871、rs1800872和rs1800890位點的單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致6歲之前因支氣管炎住院的學(xué)齡前兒童免疫力受損，導(dǎo)致后期出現(xiàn)過敏和哮喘的風(fēng)險增高^［6］。而國內(nèi)邢飛等人研究發(fā)現(xiàn)，IL-10基因啟動子rs1800871 位點的單核苷酸多態(tài)性可能與安徽皖南地區(qū)漢族人群哮喘無關(guān)，而與rs1800896和rs1800872位點的單核苷酸多態(tài)性相關(guān)^［7］。RAEISZADEH JAHROMI等人也發(fā)現(xiàn)IL-10基因啟動子rs1800896 位點的單核苷酸多態(tài)性與輕度哮喘有關(guān)^［8］。KOPONEN等人發(fā)現(xiàn)IL-10基因啟動子rs1800896位點的單核苷酸多態(tài)性與0～6 個月曾感染毛細(xì)支氣管炎的學(xué)齡前兒童發(fā)生哮喘相關(guān)，且rs1800896的等位基因A（野生基因型）是學(xué)齡前兒童發(fā)生哮喘的危險因素^［9］。 HOLSTER等人研究發(fā)現(xiàn)，IL-10基因啟動子rs1800896位點變異的等位基因G與等位基因A（野生基因型）相比，于5～7歲和11～13歲持續(xù)性哮喘的發(fā)病率降低，且吸入性糖皮質(zhì)激素（ICS）的使用頻率減少，認(rèn)為IL-10基因啟動子rs1800896位點的變異等位基因G對哮喘具有保護(hù)作用^［10］。IMANI等人分析發(fā)現(xiàn)，IL-10基因啟動子rs1800896位點的單核苷酸多態(tài)性能夠降低非洲人群顯性模型（GG+GA）和雜合子模型（AG）感染哮喘風(fēng)險并具有保護(hù)作用^［11］。 DASTGHEIB等人經(jīng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，IL-10基因啟動子rs1800896位點中等位基因G>等位基因A組與亞洲人和中國人的兒童哮喘顯著相關(guān)，但與全球人群的兒童哮喘風(fēng)險無關(guān)^［3］。因此，在遺傳因素和遺傳調(diào)節(jié)免疫方面顯然存在顯著的個體差異^［9］。也需要在不同的人群樣本中進(jìn)行更多的遺傳關(guān)聯(lián)研究^［2］。我們針對IL-10基因啟動子rs1800896和rs1800871位點各基因型和等位基因的分布頻率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，然而在哮喘組和健康組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；IL-10基因啟動子rs1800896和rs1800871位點基因多態(tài)性均不能增加哮喘發(fā)生的危險性。因此，認(rèn)為IL-10基因啟動子rs1800896和rs1800871位點的多態(tài)性可能與廣西黑衣壯族患兒支氣管哮喘無關(guān)。

由于同一基因位點在不同地域人種中的研究結(jié)果不相同。因此，進(jìn)一步研究不同人種及不同地域人群的基因多態(tài)性很有必要。通過與ensemble數(shù)據(jù)庫公布的千人基因組計劃中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)廣西壯族兒童IL-10基因啟動子rs1800896位點和rs1800871位點各基因型和等位基因分布頻率與ＥＳＮ（非洲尼日利亞人）、YRI（非洲尼日利亞伊巴丹的魯巴人）、IBS（西班牙伊比利亞人）、GIH（美國休斯敦的古吉拉特印第安人）人群相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而與CHS（中國南方漢人）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明，IL-10基因啟動子rs1800896位點和rs1800871位點基因多態(tài)性與種族和地域存在密切關(guān)系，由于廣西黑衣壯族兒童與中國南方漢人的生活環(huán)境和地域相似，并同屬一個種族，因此基因多態(tài)性的差異不大。而廣西黑衣壯族兒童與ＥＳＮ、YRI、IBS、GIH生活的地域、飲食和生活習(xí)慣均不同，因此基因多態(tài)性的差異大。

我們研究了IL-10基因啟動子rs1800896和rs1800871位點的多態(tài)性各基因型和等位基因分布頻率以及與不同種族之間的差異，進(jìn)一步補(bǔ)充IL-10基因多態(tài)性在支氣管哮喘中的研究。本研究也存在不足，一方面可能由于黑衣壯族支氣管哮喘例數(shù)少，容易產(chǎn)生誤差。另一方面，未將IL-10基因多態(tài)性與臨床診斷和治療聯(lián)系起來。今后我們將繼續(xù)研究IL-10基因多態(tài)性與支氣管哮喘臨床診斷和治療之間的關(guān)系，進(jìn)一步豐富支氣管哮喘的診斷和治療的方案。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-07-22 修回日期：2022-12-05）

（編輯：梁明佩）