張光潔，全秀振，柳叢林，李小敏，彭江

1.湖南省衡陽市畜牧水產事務中心，湖南衡陽 421001；2.湖北省黃石市佳興生物科技有限公司，湖北黃石 435100

鴨呼腸孤病毒（duck reovirus，DRV）感染病例最早于1950 年由南非學者Kaschula 報道發(fā)生于番鴨中[1]，1970 年DRV 成為法國等歐洲國家商品番鴨的主要病毒病之一。Malkinson等[2]于1981 年詳細報道了番鴨呼腸孤病毒（muscovy duck reovirus，MDRV）及臨床感染病例的基本特征。通常情況下，MDRV 僅感染番鴨和半番鴨，其他品種鴨和家禽易感性較低。1997 年前后在我國福建、廣東和浙江等地的商品番鴨群出現(xiàn)MDRV 感染，當時稱“番鴨肝白點病”或“花肝病”，吳寶成等[3]于2001 年正式報道該病的病原為MDRV。然而，2006 年前后，我國部分地區(qū)北京鴨（含櫻桃谷鴨）商品代肉鴨群發(fā)生一種以脾臟斑塊樣壞死為主要特征的傳染性疫病，死亡率為5%～15%[4]。鴨群感染早期無明顯特異性癥狀，其特征性病變?yōu)槠⑴K表面有出血斑或壞死灶，后期主要表現(xiàn)為脾臟壞死、變硬和萎縮。通過對該病原進行系統(tǒng)的實驗室診斷，證實該疾病的病原是一種與MDRV 關系密切但又有明顯不同的一種鴨呼腸孤病毒，也被稱為“新型鴨呼腸孤病毒”（NDRV）。時至今日，鴨呼腸孤病毒感染已廣泛存在于我國商品鴨群，成為商品肉鴨早期最常見的病毒性傳染病之一，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失。2022 年8 月，湖南某蛋鴨場后備鴨群陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，送檢3 只30 日齡麻鴨，經剖檢和微生物學診斷，從送檢鴨的組織樣品中分離到1 株呼腸孤病毒，并對病毒的細胞培養(yǎng)特性和S1基因片段進行測序分析。

1 病料來源

湖南某鴨場送檢3 只已死亡的30 日齡麻鴨金定鴨。剖檢可見肝臟（3/3）和脾臟（2/3）腫大，其中1只鴨的脾臟（1/3）有出血斑；胰腺（2/3）有明顯的出血點；法氏囊腔有乳白色的分泌物，其他臟器病變不明顯。

2 試驗方法

2.1 細菌培養(yǎng)

無菌采集鴨肝臟組織樣本分別接種于麥康凱瓊脂平板和含2%小牛血清的胰酶大豆瓊脂平板（TSA），置于37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，觀察有無細菌生長。

2.2 病毒分離

采集鴨肝、脾、腎和法氏囊組織，混合剪碎后加入滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）充分研磨制成20%懸液，凍融3 次后經離心5 min，取上清液用0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌。取濾液經尿囊腔接種4 枚9 日齡鴨胚（0.2 mL/胚）（購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司），每隔12 h 照胚1 次，連續(xù)觀察4～5 d 后收取尿囊液接種第2 代鴨胚。

2.3 RT-PCR 檢測

參照已發(fā)表的鴨呼腸孤病毒S1 基因片段，設計合成1 對引物（上游引物NDRV-F：5’-GCAATCACGCCACTTCTAT-3’；下游引物NDRV-R：5’-GCGTCTCAACACCACCACT-3’），使用FastPureVirul DNA/RNA Mini Kit 提取試劑盒提取第2 代鴨胚尿囊液中病毒RNA，進一步利用Promega 公司GOScript Reverse Transcription Mix 合成病毒cDNA，并以合成的cDNA 為模板進行病毒基因的PCR 擴增。PCR 反應體系（20 μL）：2×Taq PCR StarMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 補充至20 μL。PCR 熱循環(huán)過程：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min 。反應結束后，取RT-PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4 病毒細胞培養(yǎng)

按照正常細胞培養(yǎng)操作技術分別制作鴨胚成纖維細胞單層和Vero 細胞單層。待細胞單層形成達85%～90%時，棄掉細胞培養(yǎng)液，用無菌PBS 輕輕沖洗細胞2～3 次，加入DMEM 稀釋的第2 代鴨胚尿囊液毒覆蓋細胞單層，37 ℃作用1 h 后棄掉接種的病毒液，加入含1%小牛血清DMEM，同時設立未接種病毒液的空白對照組，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察和記錄細胞病變情況。

2.5 間接免疫熒光染色

將Vero 細胞均勻鋪至96 孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。待單層細胞形成后，棄去細胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次，每孔接種100 μL稀釋的病毒液，空白對照每孔加100 μL DMEM，37 ℃吸附1 h 后，每孔加入100 μL 含1%小牛血清的DMEM，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞開始出現(xiàn)病變時棄去細胞維持液，加入預冷的固定液（甲醇和丙酮等體積混合液），室溫作用25 min。棄去固定液，PBS 洗滌3 次，然后每孔加入50 μL抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體（1∶1000 稀釋；中國農業(yè)大學蘇敬良教授惠贈），37 ℃孵育1 h，洗滌3次。每孔加入50 μL 稀釋1 000 倍的Dylight488 山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min，洗滌3 次后置于倒置熒光顯微鏡下觀察記錄感染細胞免疫熒光。

2.6 病毒S1 片段基因序列測定和分析

參照GenBank 發(fā)表的鴨呼腸孤病毒S1基因組序列針對該基因片段兩端設計合成1 對引物(上游引物S1-F1：5’-GCTTTTTTCTTCTCTGCCCATGG-3’；下游引物S1 -R1：5’-GATGAATAGCTCTTCTCATCGCG-3’)，利用Promega 公司的MLV 反轉錄試劑盒和病毒基因特異性引物S1-R1 進行反轉錄合成cDNA，并以cDNA 作為模板進行PCR 擴增。PCR反應體系（50 μL）：ddH2O 28 mL，5×Buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，上/下游引物各1.5 μL，模板 3 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2 μL。PCR 熱循環(huán)過程：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)；68 ℃終延伸7 min。PCR 反應產物于1%瓊脂糖凝膠電泳后，切取目的條帶，用OMEGA 膠回收試劑盒進行DNA純化。將回收產物連接于pEASY Blunt 克隆載體中，選取陽性克隆送至上海生工測序。

3 結果與分析

3.1 細菌分離

采集3 只鴨肝臟組織樣本接種胰酶大豆瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)48 h 未見有細菌生長，因此，排除沙門氏菌等細菌性病原因素。結合病理變化，初步懷疑為鴨呼腸孤病毒引起的發(fā)病與死亡。

3.2 病毒分離

經過過濾處理的組織樣本接種4 枚9 日齡鴨胚后觀察5 d 全部存活，收集尿囊液接種3 枚鴨胚至第5 天仍存活，但檢查感染鴨胚可見胚體表面有明顯的出血斑點，其中1 枚鴨胚（1/3）肝臟有明顯的壞死灶。分別收集3 枚感染鴨胚的尿囊液，利用1%雞紅細胞進行血凝試驗，均無血凝活性。

3.3 病毒核酸PCR 檢測

將第2 代鴨胚尿囊液混合提取病毒RNA，利用引物反轉錄合成cDNA 并進行PCR 檢測，結果針對鴨呼腸孤病毒S1 基因片段的引物擴增出與其大小片段，表明該樣品中含有鴨呼腸孤病毒（圖1），命名為SDLQ。隨后對尿囊液樣本進行番鴨呼腸孤病毒、坦布蘇病毒、鴨肝炎病毒、鴨星狀病毒及鴨細小病毒等病毒核酸檢測，結果均為陰性。

圖1 病毒核酸RT-PCR 檢測電泳圖

從左到右各泳道分別為DNA 分子量標準、分離毒SDLQ 樣本、鴨呼腸孤病毒陽性對照和陰性對照。

3.4 病毒細胞培養(yǎng)及免疫熒光檢測

將含有呼腸孤病毒SDLQ 的第2 代鴨胚尿囊液用DMEM 做10 倍稀釋接種鴨胚成纖維細胞單層，感染后48 h 左右出現(xiàn)細胞病變，部分感染細胞脫落使得細胞之間的間隙明顯擴大并有合胞體形成（圖2a、圖2b），至96 h 左右部分感染細胞脫落。將成纖維細胞培養(yǎng)的病毒液接種Vero 細胞單層，第1 代在感染后72 h 可見有合胞體形成（圖2c、圖2d），隨后細胞病變發(fā)展，至完全脫落，隨著病毒在細胞傳代次數(shù)的增加，病變出現(xiàn)的時間縮短，傳至第5 代感染細胞在24 h 左右即可觀察到合胞體。利用鴨呼腸孤病毒特異性單克隆抗體染色，可見細胞合胞體內大量的藍綠色熒光（圖2e、圖2f）。

3.5 病毒S1 基因測序與分析

利用病毒S1 基因片段兩端特異性引物進行PCR 擴增獲得SDLQ 毒株的S1 基因完整的1 568 bp片段，序列比對分析結果顯示該分離株與國內流行的NDRV 分離株核酸同源性為94.7%～98.1%，與NDRV 分離株HN5d 的同源性最高。利用Mega 11.0.13 軟件，采用近鄰相接法（neighbor-joining method）進行遺傳進化，分析結果進一步顯示該毒株屬NDRV 基因群（圖3）。

圖3 鴨呼腸孤病毒分離株SDLQ 的S1 基因核苷酸序列遺傳進化分析

4 討論

鴨呼腸孤病毒感染嚴重危害商品水禽養(yǎng)殖業(yè)的生產，鑒于缺乏有效的免疫預防措施以及水禽養(yǎng)殖業(yè)生物安全條件較差，目前該病仍呈擴散趨勢。一方面，臨床分離株呈現(xiàn)明顯的遺傳多樣性[5-6]；另一方面，感染宿主及發(fā)病日齡也有所擴展，表現(xiàn)4周齡左右感染病例明顯增加，甚至出現(xiàn)成年鴨感染病例等[7]。隨著感染鴨日齡的增長，許多病例缺乏脾臟壞死等特征性病理變化，給臨床診斷增加了難度。本研究采用鴨胚接種方法從30 日齡死亡的麻鴨組織樣品中分離到1 株鴨呼腸孤病毒SDLQ，該毒株可以在鴨胚成纖維細胞和Vero 細胞中繁殖并引起明顯的細胞病變，表明鴨胚接種和細胞培養(yǎng)是鴨呼腸孤病毒分離培養(yǎng)的良好實驗室宿主系統(tǒng)，結合RT-PCR 檢測病毒核酸或單克隆抗體免疫染色可以做出準確的實驗室診斷。

鴨呼腸孤病毒屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的禽呼腸孤病毒亞群。病毒S1 基因編碼病毒外衣殼蛋白σC、非結構蛋白p10 及p18 等，在病毒感染及誘導機體產生中和免疫抗體反應等方面起著重要作用[8-9]。不同毒株編碼σC 的基因序列的差異可能導致病毒感染或免疫誘導中和抗體的保護效果不同，因此被很多研究人員用于分析呼腸孤病毒的遺傳學進化和基因分型等[10-11]。本研究對SDLQ株的S1 基因分析結果顯示，該毒株與我國流行的新型鴨呼腸孤病毒同源，且與近幾年報道的毒株的核酸同源性很高，說明現(xiàn)階段鴨呼腸孤病毒主要抗原未發(fā)生顯著變化。