王晨辰 韓雨薇 李曉明

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂是導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）的主要原因，致殘率、病死率高[1，2]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤的檢出率明顯增高。目前，顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤的治療尚無(wú)統(tǒng)一意見(jiàn)，需要權(quán)衡動(dòng)脈瘤破裂的風(fēng)險(xiǎn)和外科治療的風(fēng)險(xiǎn)之間利弊。動(dòng)脈瘤的發(fā)展變化會(huì)引發(fā)一系列的分子事件，導(dǎo)致一些具有潛在的生物標(biāo)志物特征的物質(zhì)釋放到外周血。如果能夠在外周血找到與動(dòng)脈瘤破裂相關(guān)的預(yù)警生物標(biāo)記物，則有助于動(dòng)脈瘤臨床治療方案的選擇。我們采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)檢測(cè)顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤和顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤病人血漿蛋白的差異表達(dá)譜，并采用生物信息學(xué)方法分析，為尋找出血漿潛在的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血漿來(lái)源收集2019年1～12月收治的10例顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤病人血漿10份，同時(shí)收集年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓以及動(dòng)脈瘤位置等相匹配的10例顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤血漿10 份作為對(duì)照組。兩組病人基線資料見(jiàn)表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組病人均知情并簽署同意書(shū)。

表1 兩組病人的基線資料

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：DSA或CTA證實(shí)存在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：海綿狀血管瘤；非顱內(nèi)動(dòng)脈瘤因素（血管畸形等）造成的蛛網(wǎng)膜下腔出血；夾層動(dòng)脈瘤；惡性腫瘤、自身免疫性疾病等；外院已行手術(shù)、介入治療。

1.3 樣本的采集與保存入院2 h內(nèi)采集靜脈，4 ℃條件下3 000 轉(zhuǎn)/min 離心15 min，收集上層血漿分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。

1.4 標(biāo)記前樣品準(zhǔn)備使用ProteoMinerTM 蛋白富集試劑盒（美國(guó)Bio-Rad 公司）去除血漿樣本中高豐度蛋白，胰蛋白酶消化后得到肽段，并采用C18 Cartridges進(jìn)行脫鹽，肽段真空離心干燥后以40 μl 0.1%甲酸溶液復(fù)溶。

1.5 iTRAQ標(biāo)記和LC-MS/MS分析利用iTRAQ試劑盒（美國(guó)AB SCIEX 公司）標(biāo)記肽。使用AKTA 純化系統(tǒng)（美國(guó)GE Healthcare公司）通過(guò)SCX色譜分離標(biāo)記肽。干燥的肽混合物用緩沖液A（10 mM KH2PO4，25% ACN，pH=3.0）重組和酸化，在PolySULFOETHYL 4.6×100 mM 柱上（5 μm，200 ?；美國(guó)polyylc Inc公司）上進(jìn)行分級(jí)。洗脫過(guò)程中監(jiān)測(cè)214 nm吸光度值，每隔1 min 收集洗脫組分。真空離心凍干后用C18 Cartridge脫鹽。每份樣品采用Easy nLC（上海賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行分離，在用Q Exactive 質(zhì)譜儀（上海賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行分析。

1.6 蛋白鑒定和定量使用MASCOT引擎（Matrix Science，London，UK；版本2.2）嵌入到Proteome Discoverer 1.4 軟件中對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定和定量。以表達(dá)倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）變化＞1.2倍（上調(diào)＞1.2倍或下調(diào)＜0.83 倍）且P＜0.05 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）。

1.7 生物信息學(xué)分析利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/）對(duì)DEPs 的反應(yīng)通路進(jìn)行注釋和分類(lèi)，使用OmicShare 工具（https://www.omicshare.com/tools）進(jìn)行KEGG路徑富集分析和GO分析。

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載動(dòng)脈瘤破裂的基因芯片數(shù)據(jù)GSE13353 和GSE54083，在GEO2R 平臺(tái)內(nèi)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析，選取log2 FC＞1或＜-1、P＜0.05的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。將GSE13353和GSE54083的差異表達(dá)基因以及本研究血漿樣本DEPs聯(lián)合做韋恩圖分析。

1.8 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選出的DEPs 導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/）進(jìn)行聚類(lèi)分析，引用Cytoscape軟件version 3.8.2繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，找出網(wǎng)絡(luò)核心關(guān)鍵蛋白。

2 結(jié)果

2.1 GO分析及KEGG 通路富集分析 經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出806個(gè)可定量蛋白，其中DEPs共122個(gè)，表達(dá)上調(diào)59個(gè)，表達(dá)下調(diào)63個(gè)。

DEPs 進(jìn)行BLAST2GO 注釋?zhuān)凑丈镞^(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能類(lèi)別進(jìn)行分類(lèi)：在生物學(xué)過(guò)程中，大多數(shù)DEPs主要參與“細(xì)胞過(guò)程”、“生物調(diào)節(jié)過(guò)程”和“代謝過(guò)程”等；DEPs的分子功能主要在“結(jié)合”功能中集中；而在細(xì)胞成分中“細(xì)胞”和“細(xì)胞組分”具有數(shù)量最多的DEPs。

KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，主要相關(guān)疾病為傳染性疾病和免疫疾病，也包括心血管疾病；主要富集的通路均與炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)，主要相關(guān)通路包括B細(xì)胞受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等與免疫及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)顯著相關(guān)的通路，以及MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等與在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的通路。

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)DEPs相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，白蛋白（albumin，ALB）、血紅蛋白β亞基（hemoglobin subunit beta，HBB）、鈣調(diào)蛋白1（calmodulin-1，CALM1）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（serotransferrin，TF）和載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）是網(wǎng)絡(luò)核心蛋白。

2.3 與GEO數(shù)據(jù)集交叉結(jié)果GSE13353數(shù)據(jù)集與本研究的共同差異蛋白有14個(gè)，GSE54083數(shù)據(jù)集與本研究的共同差異蛋白有3 個(gè)；其中2 個(gè)蛋白在GSE13353、GSE54083 數(shù)據(jù)集和本研究樣本中均存在交叉。

2.4 共同DEPs的情況 本研究樣本SLMAP、IQGAP3、PTPRJ、PEBP1、S100P、BASP1和AOC3等表達(dá)水平與GSE13353 數(shù)據(jù)集的動(dòng)脈瘤組織基因表達(dá)水平呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)，而且破裂動(dòng)脈瘤與未破裂動(dòng)脈瘤之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05；圖1）。

圖1 iTRAQ 技術(shù)檢測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤病人血漿差異表達(dá)蛋白與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織基因表達(dá)交叉分析

3 討論

生物標(biāo)志物有助于了解顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生長(zhǎng)與破裂的分子機(jī)制，從而開(kāi)發(fā)新的治療方法，并預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。既往研究都是在基因組學(xué)[3]和轉(zhuǎn)錄組學(xué)[4]水平進(jìn)行分析，但蛋白的翻譯和修飾也會(huì)影響其表達(dá)和功能，因此蛋白質(zhì)組水平的研究能直接反映顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的病理變化。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤壁的病理改變會(huì)導(dǎo)致一些具有潛在的生物標(biāo)志物特征的物質(zhì)釋放到外周血。血液作為疾病微環(huán)境在疾病大環(huán)境中的反饋，是最容易獲取并且方便檢測(cè)變化的，也是更具有無(wú)創(chuàng)診療應(yīng)用價(jià)值的。如果在外周血中能尋找到輔助預(yù)警顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的生物標(biāo)志物，則能夠有助于對(duì)顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤治療方案的選擇提供個(gè)體化診療的參考依據(jù)。

我們的研究以病人血漿為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤潛在生物標(biāo)記物的來(lái)源，采用iTRAQ 技術(shù)與LC-MS/MS 聯(lián)合的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，識(shí)別和量化蛋白，分析顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤與顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤的DEPs。首先，通過(guò)GO 富集分析和KEGG 通路富集分析關(guān)鍵蛋白與關(guān)鍵功能，同時(shí)運(yùn)用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片信息，驗(yàn)證得到的DEPs的動(dòng)脈瘤組織基因表達(dá)水平；再通過(guò)iTRAQ 蛋白質(zhì)組學(xué)分析與生物信息學(xué)交叉聯(lián)合，試圖尋找潛在的生物標(biāo)志物。我們確定DEPs共122個(gè)，上調(diào)59個(gè)，下調(diào)63個(gè)；功能富集分析發(fā)現(xiàn)，DEPs參與血管生成與血管通透性調(diào)節(jié)、血管損傷以及損傷后的血小板脫粒、脂質(zhì)的代謝等與動(dòng)脈瘤形成發(fā)展密切相關(guān)的反應(yīng)。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的特征是血流動(dòng)力學(xué)引發(fā)的血管內(nèi)皮功能障礙，使平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促炎表型，血管壁局灶性惡化，粘液物質(zhì)在內(nèi)膜和中層沉積，內(nèi)彈力板斷裂導(dǎo)致動(dòng)脈壁彈力變?nèi)鮗5]。動(dòng)脈壁細(xì)胞丟失、泡沫化最終導(dǎo)致動(dòng)脈瘤破裂[6]。研究證實(shí)切應(yīng)力誘導(dǎo)一氧化氮的產(chǎn)生、平滑肌細(xì)胞的表型改變和凋亡、炎癥和遺傳等因素，都參與動(dòng)脈瘤的形成和破裂[6]。

本文結(jié)果顯示APOA1 是蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的核心蛋白。APOA1 是高密度脂蛋白的主要載脂蛋白，能夠誘導(dǎo)清除血管壁細(xì)胞內(nèi)積聚的脂質(zhì)，從而啟動(dòng)反向膽固醇運(yùn)輸途徑。有免疫組化染色研究表明，APOA1 與動(dòng)脈瘤破裂的臨床危險(xiǎn)因素呈負(fù)相關(guān)，這可能和APOA1通過(guò)抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎和抗氧化功能在動(dòng)脈瘤壁變性中發(fā)揮保護(hù)作用有關(guān)[7]。我們發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤病人血漿APOA1 表達(dá)與顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤病人相比顯著上升。

ALB 是一種急性相反應(yīng)物，可以預(yù)防或恢復(fù)由溶血性磷脂酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等血管功能障礙，同時(shí)可以結(jié)合游離脂肪酸，阻斷病理性脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[8]。因此，顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤病人血漿ALB升高可能對(duì)動(dòng)脈瘤具有保護(hù)作用。巨噬細(xì)胞中鐵蛋白的增加對(duì)細(xì)胞鐵代謝起作用，也對(duì)炎癥反應(yīng)起作用[9]。而鐵缺乏在的炎癥性疾病中很常見(jiàn)，是影響發(fā)病率和病死率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中鐵缺乏即可由TF 的飽和度來(lái)定義[10]。我們推斷TF 在顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤病人血漿中表達(dá)下調(diào)可能與炎癥相關(guān)。PTPRJ蛋白在血管生成中顯示出重要作用，其過(guò)表達(dá)會(huì)使細(xì)胞間黏附分子和血管細(xì)胞間黏附分子的mRNA水平顯著升高，表明PTPRJ 基因在內(nèi)皮細(xì)胞中具有促炎、促凋亡作用[11]。我們發(fā)現(xiàn)PTPRJ 在顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤病人血漿中表達(dá)升高。此外，有研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-9 在顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤組織和病人血清中表達(dá)升高，ORM1 在顱內(nèi)未破裂動(dòng)脈瘤組織中也存在表達(dá)升高的現(xiàn)象[12]。

綜上所述，我們運(yùn)用iTRAQ 與LC-MS/MS 聯(lián)合的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，成功篩選出與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的血漿候選生物標(biāo)志物。從本質(zhì)上講，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的破裂主要與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等相關(guān)，多種機(jī)制共同作用導(dǎo)致不良結(jié)局。我們蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)分析篩選出介導(dǎo)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的關(guān)鍵蛋白，同時(shí)通過(guò)功能分析發(fā)現(xiàn)DEPs與炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)。這為了解顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病的分子機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)提供了新的線索。當(dāng)然，這些蛋白質(zhì)在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的真正作用尚不清楚，還需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。