宋單波,張國(guó)新,王 權(quán),劉保軍,黃 濤,韓宏偉,白劍宇,郭慶元

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830091;2.烏魯木齊海關(guān)動(dòng)植物檢疫處,烏魯木齊 830011;3.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所,烏魯木齊 830063)

0 引 言

【研究意義】巴旦木為薔薇科李亞科桃屬喬木,學(xué)名為扁桃[1]。巴旦木杏仁含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]。而且鎂、鈣和鉀等微量元素的含量也很高[4]。在我國(guó),巴旦木主要分布在新疆、四川,河南和河北等省市[5-6],其中新疆是我國(guó)巴旦木的主產(chǎn)區(qū),主要分布在喀什地區(qū)莎車(chē)縣和英吉沙縣。近年來(lái),南疆地區(qū)巴旦木,病蟲(chóng)害的發(fā)生與危害也有所加重。巴旦木細(xì)菌性穿孔病主要危害巴旦木的葉片和果實(shí),形成近圓形或不規(guī)則形黑褐色病斑,具黃色暈圈,葉片上的病斑后期干枯脫落,形成穿孔,影響巴旦木的光合作用,造成巴旦木的產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低。研究該病致病病原,分析病原菌生物學(xué)特性及室內(nèi)防控藥劑初選,對(duì)田間高效防控藥劑的篩選有重要意義。【前人研究進(jìn)展】2004年唐德志等[7]對(duì)扁桃病害統(tǒng)計(jì)中報(bào)道了扁桃細(xì)菌性穿孔病主要由黃單胞桿菌造成。趙震宇[8]報(bào)道了尾孢屬真菌引起扁桃白斑病,臧旭陽(yáng)等[9]報(bào)道扁桃葉斑病是由3種真菌復(fù)合侵染造成,其中鏈格孢菌是扁桃葉斑病的致病優(yōu)勢(shì)種,其危害癥狀與細(xì)菌性穿孔病極為相似。2020年,在新疆莎車(chē)縣巴旦木種植園發(fā)現(xiàn)了一種危害巴旦木的新病害,其發(fā)病癥狀與桃細(xì)菌性穿孔病相似,全園株發(fā)病率高達(dá)90%以上,果實(shí)發(fā)病率在30%以上。【本研究切入點(diǎn)】巴旦木細(xì)菌性穿孔病是2020年在我國(guó)新疆發(fā)現(xiàn)的一種新病害,病原為由假單胞菌(Pseudomonassp)侵染引起,由于對(duì)該病害侵染循環(huán)規(guī)律的研究尚處于初始階段,在病害防控方面無(wú)直接的文獻(xiàn)資料做參考。需開(kāi)展病原菌生物學(xué)特性和室內(nèi)藥劑篩選,能為病害的高效防控提供指導(dǎo)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)病原菌在不同的溫度、pH、NaCl濃度、培養(yǎng)基等條件下生長(zhǎng)情況,研究不同藥劑對(duì)病原菌的抑制效果,分析病原菌的主要生物學(xué)特性,初選出抑菌效果明顯的防控藥劑,為田間病害的高效防控技術(shù)的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

XJsc-13,采自喀什地區(qū)莎車(chē)縣,經(jīng)分離純化和準(zhǔn)確鑒定的代表菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

NA:5 g/L牛肉膏、5 g/L蛋白胨、5 g/L NaCl、 15～18 g/L瓊脂、蒸餾水1 L,調(diào)pH至7.2。

PDA:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉18～20 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調(diào)至7.0。

YEM:甘露醇10 g/L、酵母膏3 g/L、氯化鈉0.2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調(diào)至7.2。

LB:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、蒸餾水1 000 mL、pH調(diào)制7.0。

SPA:蔗糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水硫酸鎂0.25 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調(diào)至7.2。

BPA:蛋白胨5～10 g/L、蔗糖10 g/L、牛肉膏3 g/L、酵母提取物1 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調(diào)至7.0。

1.1.3 供試藥劑

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]以及生產(chǎn)中常用的殺菌劑,選擇其中的12種作為供試藥劑。表1

表1 供試藥劑名稱(chēng)、劑型及生產(chǎn)廠家

1.2 方 法

1.2.1 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

(1)接種液制備

將菌株XJsc-13在NA平板上活化,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用接種環(huán)挑取活化后的單菌落,接種于100 mL的液體培養(yǎng)基NA中,在160 r/min、28℃條件下中震蕩12 h左右,再用分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值,當(dāng)OD600值達(dá)到1.0左右時(shí)的菌懸液作為接種液。

(2)不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

取制備好的菌懸液0.1 mL接種于盛有NA、LB、SPA、YEM、BPA、PDA液體培養(yǎng)基的試管中,每個(gè)試管裝有10 mL液體培養(yǎng)基,每個(gè)處理重復(fù)3次,以相同培養(yǎng)液接種未培養(yǎng)的菌懸液為對(duì)照。

(3)pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)NA液體培養(yǎng)基的pH值,配制不同pH值的NA培養(yǎng)基,pH值分別為3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11、12,共13個(gè)梯度,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

(4)不同溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為5、10、15、20、25、28、30、35、40、45和50℃,共11個(gè)溫度梯度,每個(gè)溫度設(shè)3次重復(fù)。

(5)不同碳氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

以SPA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,把其中的蔗糖分別用麥芽糖、乳糖、淀粉、蔗糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、木糖等質(zhì)量的碳代替,把其中的蛋白胨分別用NH4Cl、牛肉膏、酵母膏、草酸銨、賴氨酸、甘氨酸、胰蛋白胨等質(zhì)量的氮代替,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

(6)NaCl濃度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

在NA培養(yǎng)液中加入NaCl將終濃度分別設(shè)定為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%和12%,共13個(gè)濃度梯度,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

(7)致死溫度測(cè)定

根據(jù)不同溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)影響的測(cè)定結(jié)果,致死溫度測(cè)定區(qū)間設(shè)置在45～50℃,設(shè)定46、47、48、49和50℃等5個(gè)溫度。分別取500 μL病原菌菌懸液加入1.5 mL滅過(guò)菌的離心管震蕩混勻后,放入設(shè)定好的恒溫水浴鍋中,每個(gè)溫度處理10 min后取出,取100 μL涂布到NA培養(yǎng)基平板中,置于28℃培養(yǎng)5～7 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況,每個(gè)處理設(shè)定3次重復(fù),依據(jù)菌落的有無(wú)判斷病原菌的致死溫度。

以上試驗(yàn)(除溫度試驗(yàn)外)在搖床為160 r/min、28℃條件下中震蕩24 h左右,再用分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值。

1.2.2 室內(nèi)藥劑毒力篩選

(1)含菌平板的制備

將單菌落放入NA培養(yǎng)液中,28℃,160 r/min,恒溫?fù)u床中震蕩24 h后測(cè)量其OD600值,然后用滅菌水稀釋到1×10-6cfu/mL,取100 μL菌懸液均勻涂布于凝固后的NA平板表面,晾干后備用。

(2)抑菌率測(cè)定

用6 mm的打孔器打取濾紙片,高壓滅菌后晾干備用。將滅菌的濾紙片放入配制好的不同濃度的藥劑中浸泡1 min,用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片,在容器壁上控出多余的藥液,將含藥濾紙片平鋪在涂布過(guò)菌懸液的NA平板中間,每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù),以浸過(guò)無(wú)菌水的濾紙片為對(duì)照,倒置放于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,采用十字交叉法[15]測(cè)量不同藥劑在不同濃度下的抑菌圈直徑,并計(jì)算抑菌率,以藥劑有效成分濃度的對(duì)數(shù)值為自變量(X),相對(duì)抑菌率的機(jī)率值為因變量(Y),建立毒力回歸方程計(jì)算相關(guān)系數(shù)R和EC50[16]。

抑制率(%)=(處理抑菌圈直徑-對(duì)照抑菌圈直徑)/處理抑菌圈直徑×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Office 2009和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Duncan's法進(jìn)行處理間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

研究表明,病原菌在NA、YEM、LB、PDA、SPA、BPA上均能生長(zhǎng),但病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量存在明顯的差異,其中病原菌在LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量最大,其次為YEM、NA、BPA和PDA、而在SPA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)量最小。圖1

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.2 不同pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

研究表明,病原菌在培養(yǎng)液pH為5～10均能生長(zhǎng),最適pH為7.5,在培養(yǎng)液pH值小于5和高于11病原菌生長(zhǎng)幾乎停滯,不利于病原菌的生長(zhǎng)。圖2

圖2 不同pH下病原菌生長(zhǎng)變化

2.3 不同NaCl濃度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

研究表明,病原菌在NaCl濃度在0%～7%均能生長(zhǎng),NaCl濃度為1%時(shí)能促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng),當(dāng)NaCl濃度達(dá)到3%時(shí),病原菌生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制,達(dá)到7%時(shí)病原菌的生長(zhǎng)完全停滯。圖3

圖3 不同NaCl濃度下病原菌生長(zhǎng)變化

2.4 不同碳、氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

研究表明,在8種不同碳源的培養(yǎng)基中,病原菌的生長(zhǎng)量存在顯著的差異,其中在甘露醇作為碳源的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最好,其次是山梨醇和葡萄糖,而以乳糖作為碳源時(shí)生長(zhǎng)最差。在8種不同氮源的培養(yǎng)基中,酵母膏為最適合病原菌生長(zhǎng)的氮源,其次是牛肉膏和蛋白胨,3種氮源生長(zhǎng)相對(duì)差異不大,在氯化銨作為氮源的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)較差。圖4

圖4 不同碳、氮源下病原菌生長(zhǎng)變化

2.5 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

研究表明,病原菌在5～45℃均能生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為28℃,但在15℃以下和35℃以上的溫度條件下病原菌生長(zhǎng)受到抑制,在溫度達(dá)到50℃時(shí)病原菌生長(zhǎng)基本停滯。病原菌的致死溫度為50℃。圖5

圖5 不同溫度下病原菌生長(zhǎng)變化

2.6 不同殺菌劑對(duì)病原菌的抑菌效果

研究表明,12種供試藥劑對(duì)病原菌均具有一定抑菌效果,但不同藥劑和同種藥劑不同濃度的抑菌效果都存在差異。0.3%四霉素和1.2%的中生菌素抑菌效果最好,EC50最小分別為2.92、6.47 mg/L,其次是3%噻霉酮和53.8%氫氧化銅EC50分別為20.25、50.94 mg/L,80%波爾多液和30%噻唑鋅對(duì)病原菌的抑制效果較差,當(dāng)濃度達(dá)到10 000 mg/L以上才能抑制病原菌。表2

表2 12種殺菌劑對(duì)巴旦木細(xì)菌性穿孔病病原毒力測(cè)定結(jié)果

續(xù)表2 12種殺菌劑對(duì)巴旦木細(xì)菌性穿孔病病原毒力測(cè)定結(jié)果

3 討 論

研究結(jié)果表明,病原菌的最適生長(zhǎng)溫度在28℃左右,致死溫度為50℃,最適pH為7.5,最適NaCl濃度為1%。李燕等[17]在對(duì)蘋(píng)果細(xì)菌性枝枯病的病原菌(Pseudomonassyringaepv.Syringa)的生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)該病原菌最適合在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基+5%蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng),最適溫度為27℃,最適合在pH為7.5時(shí)生長(zhǎng),在0.5% NaCl的濃度最適合生長(zhǎng),張盧慧等[18]對(duì)辣椒細(xì)菌性果實(shí)條斑病的病原菌阿根廷假單胞菌生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定時(shí),最適合溫度為28℃,最適合在pH為7時(shí)生長(zhǎng)。研究中巴旦木細(xì)菌性穿孔病病原菌與這兩種假單胞菌的生物學(xué)特性存在一定的差異,巴旦木細(xì)菌性穿孔病病原菌與這兩種病原菌盡管均屬于同一屬,但具體種類(lèi)不同,與Gross等[19]報(bào)道的同屬中不同種之間,以及不同地區(qū)、不同寄主都可能存在差異的結(jié)果相吻合。

在供試的12種藥劑的室內(nèi)抑菌試驗(yàn)中,0.3%四霉素的毒力最強(qiáng),其次為1.2%中生菌素和3%噻霉酮,對(duì)巴旦木細(xì)菌性穿孔病病原菌的抑菌效果最好,可作為田間藥劑防控試驗(yàn)的備選,但不同的藥劑在不同環(huán)境條件下和不同寄主植物植株上的作用機(jī)制不同,防治效果也存在一定的差異,室內(nèi)藥劑試驗(yàn)的篩選結(jié)果并不代表抑菌效果差的藥劑的田間防治效果也差。在室內(nèi)藥劑初選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,還需要結(jié)合田間藥劑防控試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

4.1巴旦木細(xì)菌性穿孔病的病原菌在不同的溫度、pH、氯化鈉濃度、培養(yǎng)基和碳氮源等生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)情況都有著明顯的差異,在供試的8種培養(yǎng)基中,最適培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基,最適生長(zhǎng)溫度為28℃,最適合生長(zhǎng)pH為7.5,最適氯化鈉濃度為1%,致死溫度為50℃。在以甘露醇為碳源和酵母膏為氮源時(shí)生長(zhǎng)量最好,在不同的氮源中,病原菌對(duì)酵母膏利用最好,在氯化銨作為氮源時(shí),不利于病原菌生長(zhǎng)。

4.212種供試藥劑,在一定濃度范圍內(nèi)均具有一定的抑菌效果,但不同藥劑和同種藥劑不同濃度的抑菌效果都存在差異,0.3%四霉素的毒力最強(qiáng),其次為1.2%中生菌素和3%噻霉酮。