李旻玥，蔣朝芬，鐘勻，蘇正偉，李興玉，

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，云南 昆明650201

紫蘇是唇形科草本植物[1-2]，是一種傳統(tǒng)藥食同源植物，已列入《藥食同源物品名錄》[3-4]。2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中記載紫蘇性溫、味辛[5]。其藥用價(jià)值和食用方法在《本草綱目》有記載[6-7]。我國(guó)現(xiàn)已研制出10 多種含有紫蘇的中藥制劑[2]，此外，紫蘇還是一種保健品。

紫蘇的化學(xué)成分主要有黃酮類、揮發(fā)油、脂肪酸類、香豆素類等[8-9]。紫蘇在臨床上可用于治療尋常疣、魚蟹中毒[10]，可解熱、降血脂等[11]。長(zhǎng)期食用還可預(yù)防和治療心血管疾?。–VD）[12-14]。

CVD 是一種常見(jiàn)慢性疾病之一。高血壓病、冠心病等都屬于CVD，CVD 患者會(huì)出現(xiàn)頭暈、心悸等癥狀。CVD 發(fā)病隱匿、并發(fā)癥嚴(yán)重，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[15-16]。在我國(guó)，CVD 的患病率逐漸上升且年輕化，根據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》概要[17]，我國(guó)CVD 患病人數(shù)近3億，若不采取措施，在今后10 年患病率和病亡率將會(huì)急劇增長(zhǎng)。全球CVD 的形勢(shì)也很嚴(yán)峻，嚴(yán)重危及患者家庭和社會(huì)[18]。

中藥紫蘇在治療CVD 方面的安全性高，有顯著療效，雖然紫蘇的多種成分已有研究，但紫蘇的全方位研究文獻(xiàn)較少，藥理作用分析不夠完善。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究紫蘇的活性成分及其治療CVD 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 紫蘇活性成分及其作用靶標(biāo)以“紫蘇”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/）中檢索得到紫蘇的全部化學(xué)成分及靶點(diǎn)，以口服生物利用度（OB）≥20%，類藥性（DL）≥0.10[19]為條件進(jìn)一步篩選紫蘇的有效化合物及其作用靶點(diǎn)。

1.2 CVD 靶點(diǎn)以“Cardiovascular”or“Cardiovascular Neurosis” or “Atherosclerosis” or “Myocardial Infarction”or“Cardiopathy”為關(guān)鍵詞在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards（https：//www.genecards.org/）和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）（https：//www.omim.org/）中檢索，刪除重復(fù)項(xiàng)得到CVD 的相關(guān)靶基因。

1.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)將紫蘇活性成分的作用靶點(diǎn)與CVD 靶點(diǎn)進(jìn)行交集，導(dǎo)入Venny 2.1 在線軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中制作韋恩圖，得到共同靶基因。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治鲈赟TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）中對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，其他條件默認(rèn)，獲得PPI 初步網(wǎng)絡(luò)。然后獲取靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件（版本3.8.2）制作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。并利用Cytoscape 軟件中cytoHubba 插件獲得degree（度值）排名前10 的核心靶點(diǎn)[20]。

1.5 “成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。其中節(jié)點(diǎn)表示紫蘇活性成分、靶點(diǎn)、通路和疾??；邊表示各節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系。

1.6 GO 功能富集分析通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）獲得GO 功能富集分析數(shù)據(jù)；再通過(guò)Cytoscape 軟件中的“BiNGO”插件獲得GO 功能富集相關(guān)數(shù)據(jù)的P-value 值。使用線上制圖工具微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 功能富集分析氣泡圖。

1.7 KEGG 富集分析利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得和KEGG 通路富集分析的數(shù)據(jù)，根據(jù)富集的基因數(shù)目選取最多的前20 條信號(hào)通路，利用線上制圖工具微生信平臺(tái)繪制KEGG 氣泡圖。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證選取成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中degree 值較高的4 個(gè)關(guān)鍵化合物和KEGG氣泡圖中最重要的前4 條信號(hào)通路對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，用Chem 3D 進(jìn)行能量最小化處理后作為配體，運(yùn)用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入Pymol 軟件進(jìn)行處理后作為受體。利用AutoDock 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并運(yùn)用Pymol 軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇有效成分及靶點(diǎn)篩選見(jiàn)表1。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢312 種紫蘇化學(xué)成分，根據(jù)OB≥20%，DL≥0.10 的條件篩選后有41 個(gè)活性成分。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中Related Targets 獲得主要活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)2 481個(gè)，去除重復(fù)值后用Perl 軟件以Symbol 形式標(biāo)準(zhǔn)化后得94 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 紫蘇活性成分

2.2 CVD 靶點(diǎn)篩選通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到15 227 個(gè)靶基因，通過(guò)OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到36 個(gè)靶基因，數(shù)據(jù)整合并刪除重復(fù)值后得到15 138 個(gè)CVD 相關(guān)靶蛋白基因。

2.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)見(jiàn)圖1。通過(guò)Venny 2.1將94 個(gè)紫蘇藥物靶點(diǎn)和15 138 個(gè)CVD 靶點(diǎn)交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)89 個(gè)。

圖1 紫蘇活性成分靶點(diǎn)與CVD 靶點(diǎn)交集

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建見(jiàn)圖2～3。將89 個(gè)共同靶點(diǎn)提交至STRING 平臺(tái)，研究物種設(shè)置為“Homo sapiens”，分析獲得初步網(wǎng)絡(luò)后，再獲取相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖包含節(jié)點(diǎn)86個(gè)，邊848 條。獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖后，利用Cytoscape 軟件中cytoHubba 插件獲得degree 排名前10 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為CASP3、CTNNB1、MYC、ALB、HIF1A、CCND1、FOS、VEGFA、CASP8、MDM2。上述靶點(diǎn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)揮了重要作用，可能為紫蘇與CVD 關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的高密度子網(wǎng)

2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖4。以上述得到的41 個(gè)紫蘇活性成分、246 靶點(diǎn)、30 條關(guān)鍵通路和CVD 為基礎(chǔ)構(gòu)建“Node”與“Style”文件，導(dǎo)入到Cytoscape 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)。利用插件Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，共166 節(jié)點(diǎn)，659 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為7.94。由圖可知一個(gè)活性成分和多個(gè)靶點(diǎn)及通路相連，一個(gè)靶點(diǎn)連接多個(gè)活性成分和靶點(diǎn)，這說(shuō)明紫蘇治療CVD可能是多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用結(jié)果。化學(xué)成分木犀草素、芹菜素、β-胡蘿卜素和β-谷甾醇連接度最高，鑒定為主要活性成分；與活性化合物連接度最高的靶點(diǎn)有CASP3、CTNNB1 等靶點(diǎn)，鑒定為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)；與關(guān)鍵靶點(diǎn)連接度最高的有Pathways in cancer（P1）、Prostate cancer（P2）等，鑒定為重要生物學(xué)通路。

圖4 紫蘇治療CVD 的成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 功能富集分析見(jiàn)圖5～7。將89 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)并導(dǎo)出GO 功能富集數(shù)據(jù)，進(jìn)行分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）和細(xì)胞組分（CC）分析，篩選P-value 值前10 條利用微生信平臺(tái)繪制氣泡圖。GO 富集分析結(jié)果顯示，紫蘇治療CVD 共涉及85 個(gè)與MF 相關(guān)過(guò)程，富集度排前10 主要集中于結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等方面；936 條BP 通路，排在前10 其中主要生物過(guò)程有化學(xué)反應(yīng)、有機(jī)物反應(yīng)等；共有59 條CC 過(guò)程，富集度前10 主要涉及蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腔等。

圖5 GO 分子功能（MF）富集分析

圖6 GO 生物過(guò)程（BP）富集分析

圖7 GO 細(xì)胞組成（CC）富集分析

2.7 KEGG 富集分析見(jiàn)圖8。主要有Pathways in cancer、Prostate cancer 等。通過(guò)KEGG 通路富集分析條形圖直觀地展現(xiàn)了每條信號(hào)通路中紫蘇抗CVD靶點(diǎn)的富集比，圖中縱坐標(biāo)表示富集通路的名稱，橫坐標(biāo)表示富集的基因數(shù)目。

圖8 KEGG 通路富集分析

2.8 分子對(duì)接見(jiàn)表2、圖9。從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載木犀草素、芹黃素、β-胡蘿卜素和β-谷甾醇的2D 結(jié)構(gòu)。從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載CCND1、CASP3、CTNNB1、MYC、HIF1A、VEGFA、FOS、MDM2 和CASP8 蛋白的PDB 文件，處理后用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接。能量越低，配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大。當(dāng)結(jié)合能絕對(duì)值＞4.25 表示分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合能力，絕對(duì)值＞5.0 表示結(jié)合能力較強(qiáng)，絕對(duì)值＞7.0 表示結(jié)合能力很強(qiáng)[21]。

圖9 紫蘇活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接

表2 紫蘇活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的最低結(jié)合能

分子對(duì)接的最低結(jié)合能結(jié)果顯示，CCND1、MDM2 與芹黃素、木犀草素有很強(qiáng)的結(jié)合活性；CASP3 與芹黃素、木犀草素、β-胡蘿卜素有較強(qiáng)的結(jié)合活性，與β-谷甾醇有一定的結(jié)合活性；VEGFA與芹黃素、木犀草素有較強(qiáng)的結(jié)合活性；CASP8 與β-胡蘿卜素、β-谷甾醇有較強(qiáng)的結(jié)合活性；HIF1A、FOS 與芹黃素有很強(qiáng)的結(jié)合活性；CTNNB1與β-胡蘿卜素有較強(qiáng)的結(jié)合活性；MYC 與β-胡蘿卜素有很強(qiáng)的結(jié)合活性。

3 討論

CVD 已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的疾病之一，全球約有1/3 的人死于CVD[22]。國(guó)內(nèi)外研究表明，中醫(yī)藥可以從患者的具體病癥出發(fā)，保護(hù)靶器官，預(yù)防多種并發(fā)癥，能很好地預(yù)防CVD 的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)病癥，所以中醫(yī)在防治CVD 方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)了“治未病”的特色[23]。

本研究篩選得到紫蘇治療CVD 的活性成分4個(gè)，分別為β-谷甾醇、木犀草素、β-胡蘿卜素和芹黃素。關(guān)鍵作用靶點(diǎn)為CCND1、CASP3、CCNNB1、MDM2、VEGFA、HIF1A、MYC、FOS 和CASP8。重要生物學(xué)路徑為Pathways in cancer、PI3K-Akt、Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection、Prostate cancer。核心作用網(wǎng)絡(luò)如圖10 所示，紫蘇治療CVD 具有多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，4 個(gè)主要活性成分作用于9 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)4 條重要生物學(xué)路徑發(fā)揮治療作用。其中4 個(gè)主要成分的結(jié)構(gòu)式如圖11 所示。

圖10 紫蘇治療CVD 的核心網(wǎng)絡(luò)

圖11 紫蘇的主要活性成分

芹黃素是一種黃酮類化合物，別名洋芹素、芹菜素。國(guó)內(nèi)外研究證明，芹黃素有很多生物活性，可以抗腫瘤、保護(hù)心腦血管等。芹黃素通過(guò)抑制血小板花生四烯酸代謝的途徑來(lái)改善動(dòng)脈粥樣硬化和血栓的形成[24]。β-胡蘿卜素也稱葉紅素，屬于類胡蘿卜素，可以抗氧化、抗癌和預(yù)防CVD，因此在食品生產(chǎn)中常用作添加劑[25]。木犀草素是黃酮類化合物，具有多種藥理活性，可以消炎、降尿酸等，臨床上用于治療CVD[26]。β-谷甾醇具有祛痰、抑制腫瘤等作用，用于慢性氣管炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥[27]等。這4 種活性成分對(duì)治療CVD 都有一定的療效，紫蘇可能通過(guò)以上4 種成分防治CVD，說(shuō)明本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果有一定的可行性。

CASP3 即胱天蛋白酶3，可以發(fā)起細(xì)胞內(nèi)源性凋亡信號(hào)，與CVD 的發(fā)生有著密切的關(guān)系。細(xì)胞周期蛋白1（CCND1），可以調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞分裂。VEGFA 由多種細(xì)胞分泌，被認(rèn)為是一種重要的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及血管通透性的調(diào)節(jié)因子。CTNNB1、MYC、FOS、CASP8 都屬于原癌基因。本研究表明紫蘇藥物可能作用于這些靶點(diǎn)調(diào)控CVD。

PI3K-Akt 信號(hào)通路與細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇有關(guān)，關(guān)系著細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。Pathways in cancer、Prostate cancer 等都和CVD 有著一定的關(guān)系，不好的飲食習(xí)慣會(huì)刺激FOS、CASP8 等原癌基因的表達(dá)，誘發(fā)癌癥。研究表明，CVD 和癌癥有著密切的關(guān)系，二者會(huì)相互促進(jìn)加重[28]，因此這些通路是主要的信號(hào)通路。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步揭示了紫蘇在預(yù)防和治療CVD 方面具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用特點(diǎn)。不僅為紫蘇的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為將來(lái)相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，而且為傳統(tǒng)中藥材作用機(jī)制的研究提供新的思路。